快速并行检测多种血流感染病原菌的量子点多色荧光HCR新技术的研究

随着抗肿瘤药物、免疫抑制剂等使用的增加和各种侵袭性操作应用范围的日益扩大,血流感染的发生率呈逐年递增趋势，然而目前临床常规血流感染病原菌检测方法，存在着耗时长、操作繁琐等问题，不能满足临床早期诊断的迫切要求。本研究基于前期单色荧光杂交链反应（HCR）研究结果，充分利用锁核酸与DNA杂交的高特异性和量子点材料的高灵敏性，通过同一波长光激发不同粒径量子点发出不同颜色荧光，拟建立一种全新的操作简便、灵敏度高、特异性强，且无需PCR扩增，可快速并行检测多种血流感染病原菌基因组DNA 的量子点多色荧光HCR技术，期望大大缩短病原菌检测时间（预计1小时内可完成检测），并且克服现有分子诊断学技术操作繁琐、技术难度大等瓶颈问题。进一步通过对HCR动力学、影响因素及自动化等方面的研究，优化检测体系，增加检测通量。本研究结果可为病原微生物的快速检测乃至其他疾病基因检测提供一种新途径，具有广阔的临床应用前景。

随着抗肿瘤药物、免疫抑制剂等使用的增加和各种侵袭性操作应用范围的日益扩大,血流感染的发生率呈逐年递增趋势，然而目前临床常规血流感染病原菌检测方法不能满足临床早期诊断的迫切要求。杂交链反应技术巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性，通过DNA聚合释放的自由能驱动分子级联放大，在分子识别杂交的同时增强检测信号，可以快速检测目标序列。本项目利用了杂交链反应的技术特点，结合量子点多色荧光共振能量转移技术，利用病原菌16S rDNA的分子生物学特点，建立了一种操作简单、快速、准确的血流感染病原菌检测方法。课题组完成了致病菌16S rDNA检测靶点的选择，设计出针对7种常见血流感染病原菌的杂交链反应特异性发夹探针组；筛选和制备出量子点材料，优化了杂交链反应探针的量子点标记方法，建立了基于量子点HCR的多色荧光共振能量转移检测方法，构建了针对血流感染病原菌的多色荧光HCR检测方法；完成了多色荧光HCR检测方法基本参数的研究，探讨影响因素及环境参数，优化了多色荧光杂交链反应技术检测体系；完成临床对比实验的研究。研究结果显示，所构建的多色荧光杂交链反应方法检测灵敏度为0.05μM，检测其所针对的靶病原菌引起的荧光信号强度比其检测非靶病原菌引起的荧光信号强度相差45倍，具有较好的特异性，检测临床标本的准确率为94.1 %。与临床传统检测方法相比，极大地缩短了检测时间（1小时内完成检测），整个检测反应体系简单，无需酶及其他复杂的分子生物学试剂，试剂可制备成干粉运输及保存，可用于临床血流感染疾病快速诊断。同时，本项目研究结果也将为临床病原微生物以及疾病基因检测提供一种新方法。研究成果共发表论文7篇，获得国家发明专利1件（专利授权号：ZL200910250898.7）申报国家发明专利2件（专利申请号：ZL 201210076645.4、ZL 201210103243.9），2011年获中华预防医学科学技术奖一等奖1项，2012年获得全军检验医学大会优秀论文一等奖1项，培养硕士生1名。