基于高压脉冲电场大豆异黄酮糖苷降解反应机理研究

As a kind of non-thermal, high efficiency and fast processing technology, high intensity pulsed electric field (PEF) causes increasing research attention. The research indicated that PEF technology can remarkably improve the yield of enzymatic reaction product. However, the mechanism has not been defined. In the project, soybean isoflavone glucoside will be used as the research object. The characteristic rule of soybean isoflavone glucoside degradation products and PEF parameters will be analyzed, using high performance liquid chromatography, mass spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum technology. The degradation pathway of soybean isoflavone glucoside by PEF will be determined. By researching the influence of PEF on kinetic and thermodynamic parameters, the model of enzyme kinetic and thermodynamic by PEF will be established. The influence of the structure change of β-glucosidase on enzyme activity by PEF will be revealed, using polyacrylamide gel electrophoresis, circular dichroism chromatography and fluorescence spectrum. The research results can explain the mechanism of accelerating glycosidic enzyme reaction by PEF, also provide experimental basis and theoretical explanation of science. It is favorable to guide the application of PEF in the degradation or modification of macromolecular substances. The research will provide a higher additional value processing for the utilization of soybean products.

高压脉冲电场技术（PEF）作为一种非热、高效、快速的加工技术日益引起研究的重视。目前研究发现，PEF技术能够显著提高糖苷酶解反应产物得率，但其影响机制尚不清楚。本项目拟以大豆异黄酮糖苷为研究对象，采用高效液相色谱、质谱和核磁共振光谱等技术，分析PEF作用下大豆异黄酮糖苷降解产物与PEF参数间的特征规律，确定PEF作用下大豆异黄酮糖苷降解途径；研究PEF对酶解反应的动力学和热力学参数影响，建立PEF作用下的酶解动力学和热力学模型；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、圆二色谱和荧光光谱等技术，明确PEF下酶解反应中β-葡萄糖苷酶结构变化对活性影响。通过本项目的研究，阐明PEF促进大豆异黄酮糖苷酶解反应的作用机理，并提供科学的试验依据和理论解释，有利于指导PEF在大分子物质的降解或改性中的合理应用，为大豆产品的利用提供具有更高附加值的加工途径。

高压脉冲电场技术（PEF）是一种高效、快速的非热加工技术。本项目采用大豆异黄酮糖苷为研究对象，分析PEF技术在糖苷酶解反应中作用机制。通过比较PEF作用下不同种类β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷效果，证实PEF耦合黑曲霉β-葡萄糖苷酶制备大豆异黄酮苷元得率最高。研究PEF辅助酶水解关键因素电场强度、脉冲数、酶浓度和底物浓度对大豆异黄酮糖苷酶解效率的影响，确定PEF作用下降解产物大豆异黄酮苷元与PEF参数间的特征规律。在此基础之上，利用响应面分析法优化PEF处理的工作模式和技术参数。分析PEF作用下大豆异黄酮苷元种类和含量变化，建立PEF辅助酶解大豆异黄酮糖苷反应途径。构建基于PEF处理的酶解反应动力学和热力学模型，确定PEF辅助酶解反应最适pH值、最适温度、底物质量浓度和酶用量，通过Lineweaver-Burk法、Hanes-Woolf法和Wilkinson法分析酶解动力学参数，表明PEF作用下酶促反应米氏常数降低，最大反应速率提高，PEF作用增强了酶-底物的结合效率和产物释放效率。进一步研究发现PEF作用下β-葡萄糖苷酶所催化的水解反应的活化能和活化焓降低，活化熵升高，酶促反应所需的能垒降低。分析PEF作用下β-葡萄糖苷酶结构变化对酶活性影响，SDS-PAGE凝胶电泳测定结果表明，PEF作用没有引起β-葡萄糖苷酶分子一级结构的改变。圆二色谱和荧光光谱分析结果表明，PEF作用下β-葡萄糖苷酶的二级结构和三级结构发生变化，酶分子α-螺旋和转角含量增加，β-折叠和无规则卷曲含量降低。本项目的研究揭示了PEF促进糖苷酶解反应的作用机理，为PEF在大分子物质的降解或改性应用提供理论依据，对PEF技术在农产品加工领域应用具有指导意义。