T型钙通道在蛛网膜下腔出血后皮层播散性抑制发生中的作用及机理研究

蛛网膜下腔出血(SAH)后迟发性神经功能损害的机制不详，尚无有效治疗手段，是制约动脉瘤疗效的关键因素。许多证据显示皮质播散性抑制(CSD)可以导致皮质播散性缺血，加重缺血半暗灶能耗，导致播散性梗死，但机制不详；有研究也提示SAH存在CSD介导的脑损伤。T型钙通道是唯一的低电压激活钙通道，可在静息态触发动作电位，起到"扳机"样的作用，广泛参与可兴奋细胞的去极化。我们前期研究显示，SAH后大鼠的T型钙通道CaV3.3亚型表达增加，抑制T型钙通道可以减轻SAH后大鼠脑损伤。据此我们推测，在SAH后可能存在T型钙通道的功能、表达变化，易化了CSD的发生，最终造成SAH后较特征性的播散性脑梗死。本研究拟建立SAH的大鼠及脑片模型，结合免疫组化、膜片钳、皮层电记录、钙成像、微循环评价、基因干扰等技术观察T型钙通道功能、表达改变对SAH后CSD的影响，并探讨相关机理，期望为SAH的治疗提供潜在的治疗靶点

研究工作基本按原计划顺利进行。在体部分：建立了3种大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)模型，大体形态、尼氏染色观察损伤情况，并采用多种行为学检测进行评估，完善了基础动物模型建设。应用免疫组化、RT-PCR及Western Blot观察了T型钙通道在正常及SAH大鼠重要功能脑区的表达情况，并且分别应用T型钙通道反义寡核苷酸及多种钙通道拮抗剂进行干预，观察其行为学改变。体外部分：应用血红蛋白（Hb）模拟SAH环境构建了体外大鼠的脑片模型，建立了膜片钳电生理观测平台，运用膜片钳记录了SAH后脑片神经元T型钙通道活动的变化情况。初步结果如下：1. 两种大鼠蛛网膜下腔出血的注血模型均能较好模拟SAH，其中大鼠视交叉前注血建模其血块部位更接近临床常见的前循环动脉瘤破裂出血的部位，神经功能缺损表现更为明显，总体上更为接近临床情况，而大鼠对于枕大池注血则较为耐受； Beam Walking任务及Morris 水迷宫任务可分别从精细运动功能障碍及空间认知障碍的角度有效的评判SAH大鼠模型的神经功能损伤程度。2. 免疫组化及RT-PCR也在不同层次上证实了T型钙通道在正常成年大鼠的皮质、海马和下丘脑脑区均有分布。3. SAH建模后T型钙通道在脑内的表达有增多趋势，应用T型钙通道反义寡核苷酸组、米贝地尔干预均表现有治疗效果； Hb模拟刺激因素可以上调脑片模型的T型钙通道电流，而应用T型钙通道特异性抑制剂可以有效的减少Hb刺激后上调的T型钙通道电流。提示T型钙通道参与了SAH后大鼠CNS的损伤机制。此外，本项目结合项目进一步延伸研究的需要，同时也增加了部分研究内容：免疫荧光观察SAH后血管外膜VAF表型标志vimentin及T型钙通道α1亚基（Cav3.3）表达情况，显示SAH后外膜T型钙通道α1亚基存在表达上调；western blot 和RT-PCR方法分别检测SAH后HCN通道在脑实质的蛋白水平和mRNA水平的表达变化，并应用膜片钳记录海马CA1区HCN通道电流在Hb刺激下的变化，结果提示HCN通道可能参与了SAH后组织损伤。目前已经发表论文7篇，其中SCI 2篇，ISTP2篇。