拟南芥磷酸N-乙酰氨基葡萄糖变位酶功能鉴定及其影响蛋白糖基化的研究

UDP-GlcNAc is widely involved in several physiological activities such as protein glycosylation. The plant UDP-GlcNAc biosynthesis pathway is unknown till know. The bottleneck problem is that no plant N-acetylglucosamine-phosphate mutase (AGM) on this pathway was identified. The Arabidopsis thaliana AGM (AtAGM) was cloned and prokaryotic expressed in our lab. Based on this former result, we intend to characterization the enzymatic function of AtAGM and its role on UDP-GlcNAc biosynthesis. The effect of AtAGM on N-glycosylation,O- glycosylation and O-GlcNAc glycosylation will be studied too. Especially the AtAGM regulated N-glycosylation proteome change will be identified by glycoproteomics method. Finally, the effect of AtAGM on plant growth and stress resistance will be investigated. This application will identify the first plant AGM and elucidate its role on plant glycosylation. These results are helpful for build plant UDP-GlcNAc biosynthesis pathway and are beneficial for promote the plant glycobiology research in China. This application also is a good example for pioneering and interdisciplinary research of glycobiogy, plant physiology and proteomics.

UDP-GlcNAc在生物体内广泛参与蛋白糖基化等多种活动，具有重要功能，但其在植物中的合成途径一直未被彻底揭示，瓶颈问题在于植物UDP-GlcNAc合成途径的一个关键酶磷酸N-乙酰氨基葡萄糖变位酶(AGM)至今未被解析。申请者已克隆得到模式植物拟南芥AGM基因AtAGM并实现原核表达, 拟在此基础上，对AtAGM功能进行深入研究：确证AtAGM酶功能及其对UDP-GlcNAc合成的控制；研究AtAGM对植物多种糖基化(N-、O-、O-GlcNAc)的贡献，特别是，以糖蛋白质组学技术探究其对植物N糖基化蛋白质组的影响；进而明确AtAGM在植物生长、胁迫等生理过程中的作用。通过解析首个植物AGM酶功能尤其是其对蛋白糖基化的贡献，可完善植物中UDP-GlcNAc合成途径, 更可加深理解糖基化等糖生物学现象对植物生理的影响，为糖生物学、植物生理、蛋白质组学等多学科的前沿交叉研究提供可借鉴案例。

N-乙酰氨基葡萄糖磷酸变位酶（AGM）是UDP-GlcNAc合成途径中的第三个酶，在植物中至今未被鉴定研究。本项目以模式植物拟南芥作为研究对象，对AGM进行了体外酶学性质及体内生物学功能的系统研究，包括其对UDP-GlcNAc合成与蛋白糖基化水平的直接影响，及在植株生长发育、抗病和诱导子响应等方面的功能。在项目开展过程中，针对核心研究内容，建立和突破了相关实验技术，如建立了新的己糖磷酸变位酶活性检测方法等，同时还搭建了系统的植物蛋白糖基化检测平台，植病免疫评价体系等。在这些实验技术基础上，本项目实现了预期目标，成果如下：.从拟南芥中克隆得到Atagm1基因，实现了该基因的原核表达纯化，并建立了检测己糖磷酸变位酶活性的方法。AtAGM1对逆反应底物己糖-1-P亲和力较大，对正反应底物己糖-6-P的最大催化速率较大，AtAGM1对六种己糖磷酸异构体的催化效率大致相当。.T-DNA插入的Atagm1缺失型突变体Atagm1中UDP-GlcNAc水平较野生型大幅下降，N-糖基化、O-GlcNAc糖基化水平降低。从拟南芥蛋白中共检测到21种N-糖链，其中18种在Atagm1中显著降低。蛋白组学检测揭示Atagm1中由于蛋白糖基化不足导致部分蛋白不能进行正确折叠而进入降解途径。有趣的是Atagm1中，参与基因转录和翻译、糖基化修饰、蛋白转运、促进蛋白折叠等过程的一些关键蛋白上调，暗示着Atagm1中可能激活了某些反馈机制来缓解UDP-GlcNAc水平下降导致的糖基化水平不足。因此，AtAGM1对维持正常的蛋白糖基化水平至关重要。.Atagm1突变体由于UDP-GlcNAc水平的降低，在幼苗期存在温度依赖性的表型缺陷，根长度、发芽率和苗重降低。Atagm1突变体成苗的分枝和长角果数减少，并且开花时间延迟，纤维素和木质素含量升高。说明AtAGM1通过控制UDP-GlcNAc合成从而在维持植株的生长发育和正常细胞壁组分方面起关键作用。.在拟南芥-丁香假单胞菌番茄致病变种植病体系中研究发现，Atagm1抗病性能较野生型显著下降，并发现UDP-GlcNAc下降导致的蛋白糖基化受损是导致其抗病性能下降的部分原因。植物诱导子壳寡糖仍可诱导Atagm1抗Pst DC3000，效果较野生型稍有下降。表明AtAGM1通过控制UDP-GlcNAc合成从而在植物免疫抗病和诱导子响应过程发挥重要作用。