经鼻腔RNAi 沉默CCR3对变应性鼻炎肥大细胞影响实验研究

Mast cells is the main effector cells of allergic rhinitis.At present,the research shows that Eotaxin/CCR3 plays an important regulating effect on mast cells migration，activation .However, unfortunately, for its mechanism, we have lesser knowledge.. In our previous research,we have found that using RNA interference through the nasal cavity to silence CCR3 inhibits allergic rhinitis eosinophilic cells migration, activation and degranulation. At the same time, reduce the onset of allergic rhinitis, but its effect on mast cells needs to be further studied. For this purpose, we propose a hypothesis using RNAi through nasal cavity to silence CCR3 maybe inhibit the migration of mast cell, activation and degranulation effect, and then reduce the onset of allergic rhinitis. To verify this hypothesis, we will use the mouse model of allergic rhinitis, using real time PCR, western blot, lentiviral vector transfection and RNA interference and from the molecules, cells, tissues and animals aspects to explore the regulatory mechanism of mast cell in the treatment of allergic rhinitis. To seek new targets for treatment of allergic rhinitis and provide new ways for the treatment of allergic rhinitis.

肥大细胞是变应性鼻炎发病的主要效应细胞，目前研究表明Eotaxin/CCR3在肥大细胞迁移、活化中起重要调控作用但对其机制知之不多并存在争议；而鼻腔抗原刺激可引起骨髓炎性细胞及其祖细胞增多，提示在鼻腔和骨髓之间存在信号联系。我们前期研究显示：经鼻腔运用RNAi沉默CCR3抑制了嗜酸性细胞迁移、活化及脱颗粒作用而减轻了变应性鼻炎的发病（已在sci及中华杂志发表文章），但其对肥大细胞的作用有待进一步探讨。为此，我们提出假说经鼻腔RNAi沉默CCR3亦可能抑制肥大细胞的迁移、活化及脱颗粒作用减轻变应性鼻炎的发病。为了验证这一假说，我们将通过小鼠变应性鼻炎模型，采用real time PCR、western blot、慢病毒载体转染、RNA干扰等手段，从分子、细胞、组织以及动物整体水平等多方面探讨该治疗方法对变应性鼻炎肥大细胞作用的调控机制。寻找变应性鼻炎治疗新靶点，为变应性鼻炎治疗提供新思路。

变应性鼻炎是一种常见的上呼吸道变应性疾病，严重影响患者的工作和生活质量，迄今为止，其相关的病理机制过程尚未完全阐明，临床上缺乏特异有效的治疗靶点和干预手段，迫切需要寻找新治疗方法。肥大细胞是变应性鼻炎发病的主要效应细胞，因此抑制肥大细胞的效应功能有助于控制变应性鼻炎的发病过程。CCR3是在肥大细胞上表达的表面膜活性标志物，认为是治疗变应性鼻炎的潜在靶点。RNA干扰技术是研究控制基因表达的重要手段，而慢病毒载体因其能介导产生持久的沉默效果已成为基因治疗中稳定的有效工具。在此背景上，本课题应用RNAi技术构建靶向CCR3的RNA干扰慢病毒表达载体，分别从细胞和动物水平进行基因干预实验，以研究RNAi沉默CCR3对变应性鼻炎肥大细胞功能的影响。实验研究结果如下：1）成功构建CCR3基因RNA干扰慢病毒表达载体。经测序证实，成功构建了3条CCR3-shRNA。q-PCR和western blot测定干扰质粒对肥大细胞CCR3基因的沉默效率，其中以shCCR3-2沉默效果最佳，并用于后续实验。2）成功进行了小鼠骨髓细胞的分离及肥大细胞的体外培养，应用慢病毒介导的RNA干扰技术抑制CCR3基因在肥大细胞上的表达，观察其对小鼠肥大细胞增殖、凋亡、趋化和脱颗粒的影响，发现RNAi靶向沉默CCR3基因能够促进肥大细胞的凋亡，抑制肥大细胞的增殖、趋化及脱颗粒。3）采用鼻腔局部给药，将体外合成的干扰RNA应用于小鼠变应性鼻炎模型中，应用q-PCR和western blot方法检测各组小鼠骨髓、外周血及鼻粘膜中肥大细胞CCR3mRNA和蛋白的表达水平，采用HE染色、甲苯胺蓝染色、电镜分别观察鼻粘膜的组织病理形态、鼻黏膜中肥大细胞的浸润情况以及鼻粘膜纤毛形态。同时利用Elisa方法测定小鼠骨髓、外周血、鼻粘膜中组胺、类胰蛋白酶和前列腺素D2的表达，发现应用RNA干扰技术沉默CCR3基因能够抑制变应性鼻炎模型中肥大细胞迁移、浸润和脱颗粒作用，从而减轻了小鼠变应性鼻炎的症状及炎症反应。上述结果证实，CCR3可作为靶基因对肥大细胞的功能产生影响并调控过敏性鼻炎的发病，为进一步阐明过敏性鼻炎的发病机制奠定良好的理论基础。