基于二代测序技术研究乳腺癌干细胞响应TAM发生免疫逃逸的分子机制

The incidence of breast cancer is highest of all cancers in chinese women. People with new-onset invasive breast cancer account for 15% of the world. How to evaluate the risk of breast cancer matastasis has long been plagued with the scholars. Recent works found that regulatory T cells plays a key role in breast cancer matastasis by secreating immunosuppressive factors to inhibit cytotoxic T cells. However, blocking the effect of immunosuppressive factors partially restrains tumor development, implying that an alternative way may be involved in immune escape of cancer cells. Other crucial types of immune cell such as tissue associate macrophage (TAM) also exist in tumor. We hypothesize that tumor associated macrophage participates in mediating immune escape of breast cancer cells. In this project, we will establish an immunodeficient mouse model of breast cancer matastasis by orthotopic transplantation and discuss the effect of TAM in immune escape of cancer stem cell. With the help of next generation sequencing technology, a differential expression profile will be obtained by comparing and analysing the transcriptomes of breast stem cell, breast cancer stem cell and breast cancer stem cell in the graft site from mice with metastasis occurance, all of which are derivered from the same triple-negative breast cancer patient. Then these candidates will be overexpressed in stem cells cultured in vitro and their potential roles in stem cell invasion and matastasis will be examined. It will help us to select target molecules in immune escape of breast cancer stem cell in response to TAM and to uncover the mechanism of breast cancer matastasis. These findings will provide a new approch to establish a next generation sequencing platform for rapid risk assessment of breast cancer metastasis in the future.

乳腺癌是我国女性发病率最高的癌症，其中新发侵润性乳腺癌人数占全世界的15%。如何评估乳腺癌转移风险，一直是临床实践中的难题。研究发现调节性T细胞在诱导乳腺癌转移有关键作用，机制为分泌免疫抑制因子抑制细胞毒性T细胞。但仅阻断免疫抑制因子的作用，只能部分控制肿瘤发展，提示其他途径可能参与其中。癌组织中存在其他重要的免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。我们假设TAM参与乳腺癌细胞免疫逃逸过程。本课题拟采用原位移植方法建立免疫缺陷小鼠乳腺癌转移模型，观察TAM在癌干细胞免疫逃逸中的作用。借助二代测序技术检测同一例三阴性乳腺癌患者乳腺干细胞、癌干细胞和发生转移的小鼠移植部位癌干细胞的转录组，比对分析得到差异表达谱。体外过表达候选分子，探讨其对干细胞侵袭转移能力的影响，阐明TAM介导乳腺癌干细胞免疫逃逸的靶分子。揭示乳腺癌易转移机制，为建立乳腺癌转移风险快速评估二代测序平台提供新的靶点和研究思路。

复发转移始终是肿瘤治疗过程中难以规避和解决的重要事件。癌干细胞（CSCs）与肿瘤生长、发展密切相关，并且耐受现今绝大部分放化疗手段。数量上，它约占癌组织细胞总数的5%；性质上，具有自我更新和多细胞分化的能力。我国乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤第一位，而其中三阴性乳腺癌CSCs比例最高。尽管目前临床有一些评估乳腺癌患者复发转移风险的指标，如是否处于更年期、肿瘤大小、肿瘤组织分级分期等，但对于癌巢中CSCs状态评估尚缺乏有效的标志物。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤组织微环境中主要调控者之一。乳腺癌巢中TAM比例高，且其与疾病复发率及患者生存率呈负相关。研究表明，CSCs从免疫平衡进入免疫逃逸这段时间窗经历了免疫编辑，提示TAM的存在可重塑CSCs，但目前尚无研究对CSCs响应TAM免疫编辑过程中的相关分子机制进行全面评估。因此，我们借助二代测序技术（NGS），从转录组入手，期望找到转录水平发生改变的基因，并探讨其对CSCs表型/功能的影响。本项目以收集的6例乳腺癌巢组织（其中4例早期乳癌，1例晚期乳癌，1例含配对癌旁组织的早期乳癌）为研究对象，经消化和分选得到TAM，再按照TAM与CSCs接触悬浮培养、TAM体外培养上清刺激CSCs悬浮培养的分组原则，7-9天收集CSCs，利用Ion Torrent PGM平台对各组转录组进行测序。首先，我们由悬浮培养CSCs表型可知早期乳癌中TAM可促进CSCs体外成球，降低CSCs胞外葡萄糖摄取、增加胞内总ATP含量并影响其线粒体功能。其次，按照筛选规则，我们得到一系列目标分子如STK4、JUNB、TICAM2、GNB3、MRPL3、LAPTM4B、PCDH7等。最后，通过对测序数据进一步配对分析，我们发现STK4在经早期乳癌TAM诱导的CSCs中特异性表达上调，并发掘出STK4可能参与了FOXO介导的葡萄糖代谢通路，提示其可能是TAM调控CSCs能量代谢的关键分子，并由此影响癌巢CSCs复发转移行为。将STK4联合CSCs特异性标志物应用于乳腺癌巢中CSCs状态评估，可为乳腺癌复发转移风险快速评估二代测序平台的建立奠定理论基础，同时也可为临床乳腺癌治疗和预后判断提供可靠合适的分子检验标志物。