大豆孢囊线虫G蛋白偶联受体基因克隆及在识别寄主过程中的功能研究

Soybean cyst nematode (SCN), Heterodera glycine is one of the most important soybean pathogens which cause yield reduction in soybean. SCN can recognize the chemical signals released by host plant through chemosensory sensilla before nematode infection to plants. However, the molecular mechanism of the recognition of SCN to host signals remains unknown. To gain insight into its repertoire of the key regulation genes in host-finding stage, we investigated the transcriptome of the early second-stage juveniles of the SCN when exposed to soybean roots. Among all differentially expressed genes, three putative ortholog genes of G protein coupled- receptor (GPCR) were identified, which may play an important role in the progress of SCN perception of host chemical signals. In this study, the GPCR ortholog genes of SCN will be cloned by RT-PCR and the expression of these genes at different developmental stages and in different tissues of SCN were profiled by Real-time PCR and in situ hybridization assay, respectively. In addition, the function of SCN ortholog genes of GPCR in the perceiving host signals process will be fully analyzed via RNA interference (RNAi) and combination of nematode behavioral experiments such as chemotaxis. This research will help us to uncover the molecular mechanisms behind the chemoreception of SCN, and have important theoretical and applicable values for developing novel control strategies.

大豆孢囊线虫（SCN）是造成大豆减产的主要病害之一。SCN在预侵染阶段通过化感器识别寄主释放的化学信号，但相关分子机制的研究鲜有报道。为挖掘参与调控SCN识别寄主信号的关键基因，申请者利用RNA-seq技术分析了SCN二龄幼虫在识别大豆根阶段的基因表达变化，鉴定出3个G蛋白偶联受体（GPCR）同源基因，其表达水平受根系化学信号刺激而显著上调，暗示GPCR基因可能在SCN与寄主的识别关系中发挥重要作用。本项目拟克隆这3个GPCR同源基因，利用原位杂交及qRT-PCR技术分析GPCR基因在SCN中组织定位及不同发育阶段的表达特性；并通过RNAi技术与线虫趋化性等行为学试验相结合来研究GPCR基因在SCN识别寄主化学信号过程中的生物学功能。该项研究为进一步揭示SCN识别寄主信号的分子机理提供理论基础，并对开发新的线虫防治策略具有重要的理论和应用价值。

大豆孢囊线虫（SCN）是引起大豆减产最严重的病害之一。SCN在预侵染阶段利用化学感知功能识别寄主信号进而定位寄主，是建立寄生关系的前提条件，但相关分子机制的研究鲜有报道。为挖掘参与调控SCN识别寄主信号的GPCR基因，申请者利用已构建的线虫转录组表达库，鉴定出3个GPCR基因及其配体的同源序列。本项目通过RACE-PCR克隆潜在目标基因，利用原位杂交及qRT-PCR分析GPCR基因在SCN中组织定位及不同发育阶段的表达特性；借助RNAi技术与线虫趋化性等行为学试验相结合来研究GPCR基因及其配体在SCN识别寄主化学信号过程中的生物学功能。本项目取得的主要研究结果如下：从SCN中克隆到3个GPCR基因Hg-NPR4、Hg-NPR1、Hg-VFRa和2个Hg-NPR4的配体基因Hg-flp-1、Hg-flp-11；序列比对分析表明，Hg-NPR4、Hg-NPR1及Hg-VFRa与其他线虫A族GPCR受体，即视紫红质（rhodopsin）GPCR亚家族的序列有较高一致性，尤其是N末端包含保守的7次跨膜结构域；Hg-flp-1和Hg-flp-11成熟肽的C端都带有一个保守的FARP结构域 (X1-X2-Arg-Phe-NH2)，并且在许多其他种类线虫包括自由生线虫、动物寄生线虫及植物寄生线虫中都有相应的同源序列存在；原位杂交分析显示，Hg-flp-1和Hg-flp-11主要在J2的腹神经索组织表达，而Hg-NPR4、Hg-NPR1及Hg-VRFa并未表现出任何明显组织表达特异性；发育表达模式表明，Hg-NPR1主要在寄生阶段J2中大量表达，Hg-NPR4在寄生阶段J2及早期雌虫中表达量较高，Hg-VRFa在线虫中的整体表达水平较低，而Hg-flp-1和Hg-flp-1则在侵染阶段J2及侵染后J2中表达值最高；外源喂食Hg-NPR4-dsRNA后显著抑制Hg-NPR4表达，引起大豆根内的线虫数显著降低；体外干扰Hg-flp-1、Hg-flp-11 表达导致J2对大豆根系化学信号的趋化性显著降低，并且Hg-flp-1-dsRNA处理会进一步减少线虫的侵染率和繁殖率，暗示Hg-NRP4与配体Hg-FLP1异性互作组成的信号通路可能在SCN化学识别功能中具有重要作用。该项研究为进一步揭示SCN识别寄主信号的分子机理提供理论基础，并对开发新的线虫防治策略具有重要的理论和应用价值。