烟雾病易感基因RNF213调控内皮祖细胞增殖、迁移及分化的机制研究

Our published meta-analysis showed RNF213 gene variations were associated wtih the high risk of moyamoya disease(MMD).Our previous experiments found that knocked out the rnf213a gene in zebrafish could lead to intracranial arterial wall trunk irregular stenosis and abnormalities sprouting angiogenesis,and the abnormal morphology of endothelial cells in sprouting vessels, which was consistent with the characteristics of vascular lesions in MMD. It has been proved the vascular lesions were lesser in zebrafish knockouted ATP enzyme region and the ring finger domain of rnf213a.To further explore the formation mechanisms of abnormal vessels in MMD by the important variation p.R4810K, we analyse the effcet of RNF213 p.R4810K regulating the proliferation, migration and differentiation of endothelial progenitor cells using flow cytometry, immunofluorescence, molecular cloning and co-immunoprecipitation, and demonstrate the promting effect of interferon and hypoxia.We want to develop a rnf213a p.R4813K (RNF213 p.R4810K homologous) transgenic zebrafish with CRISPR /cas9 technology to observe the dynamic changes of vascular endothelial cells and smooth muscle cells in vivo and perfect the pathogenesis of MMD in order to provide an important target site for drug development and selection.

我们发表的荟萃分析表明，RNF213基因突变与烟雾病（MMD）的高发病风险相关。前期研究已证实敲除斑马鱼rnf213a基因可出现颅内动脉血管壁狭窄和芽生血管形成，且芽生血管的内皮细胞形态异常等MMD血管病变特征，而该基因ATP酶区和环指结构缺陷所致的血管病变程度较轻。为进一步探索RNF213 重要突变位点p.R4810K在烟雾病异常血管形成中的作用，本研究拟利用流式细胞术、免疫荧光、分子克隆、免疫共沉淀等技术分析p.R4810K突变对内皮祖细胞（内皮细胞的前体）增殖、迁移和分化的影响，以及干扰素和缺氧对该影响的促进作用。利用CRISPR/cas9技术构建rnf213a p.R4813K（RNF213 p.R4810K同源）转基因斑马鱼，活体观察该突变点对异常血管壁中内皮细胞和平滑肌细胞的影响，完善MMD的发病机制，为药物研制与筛选提供重要的靶位点。

Moyamoya 病（MMD）是儿童及青壮年脑卒中的重要原因之一。遗传易感基因RNF213在 MMD 发生发展中有重要的作用，但具体的发病机制仍存在空白。本项目从临床、细胞及动物多方面解析RNF213在烟雾病中的重要作用。其一，在临床方面，本研究建立了烟雾病及急性脑卒中患者临床数据库，发现RNF213基因突变不仅存在于烟雾病患者，还存在于非烟雾病的异常血管病变患者中（颅内动脉狭窄/闭塞、脑海绵状血管畸形）；构建的AND评分可较好地预测急性缺血性卒中患者发生医院获得性感染风险；同时早期视神经鞘直径的扩大可以预测溶栓后患者出血性转化的发生以及溶栓患者的不良预后。其二，在细胞学水平上，本研究通过流式细胞学技术检测到RNF213 p.R4810K突变患者内皮祖细胞数目增多，培养并鉴定了骨髓来源的内皮祖细胞，并利用CRISPR-Cas9技术构建了RNF213突变的内皮细胞系，证实RNF213基因敲除后小窝蛋白caveolin-1的表达下调。其三，在动物研究中，双光子显微镜下发现rnf213a完全敲除及重要功能区域（AAA + ATPase 及 Ring finger domain）敲除均可导致血管表型异常，高通量转录组学及qRT-PCR的结果提示rnf213a-/-突变斑马鱼kbtbd7和anxa6的mRNA显著下调，颅内桑葚样异常血管表型可被这两者的mRNA部分拯救，完善了血管异常的发病机制。其四，低氧预处理人胎盘间充质干细胞环状RNAs表达差异及生物信息学分析，也为烟雾病的治疗提供重要基础。本研究已发表文章8篇，其中本课题负责人作为第一作者发表SCI论文3篇，中文文章1篇，另有非第一作者文章4篇，申请专利2项，特邀会议报告1次。.本研究意义及应用前景：.（1）建立了烟雾病及急性缺血性脑卒中患者临床生物信息数据库，有利于长期随访及临床大数据分析；.（2）RNF213基因突变的内皮细胞系的构建，为探索烟雾病的发生机制奠定了细胞学基础；.（3）成功构建了RNF213基因及其重要功能区突变的斑马鱼模型，且明确了rnf213a突变通过下调kbtbd7和anxa6的表达促进颅内桑葚样血管生成，完善了颅内血管异常形成的分子机制；.（4）低氧预处理人胎盘间充质干细胞环状RNAs的表达差异与生物信息学分析，为烟雾病的治疗提供新的基础。