lnc-TBC1D19-4竞争性结合miR-146a调控角膜缘干细胞分化

The dysfunction of limbal stem cell (LSC) differentiation is the main cause of corneal blindness. The key roles of long non-coding RNA (lncRNA) and miRNA in LSC differentiation are widely generally approved, but its mechanism is still unclear. Our preliminary data showed that lnc-TBC1D19-4 is highly expressed in the LSC, but less when abnormal differentiation. The expression of miR-146a is less in the LSC, but increased significantly when abnormal differentiation. lnc-TBC1D19-4 and miR-146a expressed significant negative correlation. Based on the previous studies, we propose that: lnc-TBC1D19-4 can compete with miR-146a to reduce the Notch pathway inhibition by miR-146a.The lnc-TBC1D19-4-miR-146a-Notch pathway is important in the maintain of the normal function of LSC. These studies contain both in-vivo and in-vitro content and adopt both miRNA microarray and next generation sequencing methods. The understanding of the role of lncRNA in the differentiation of LSCs would provide new path in the treatment of dysfunction of LSC differentiation.

角膜缘干细胞正常分化功能损害是导致角膜盲的主要原因，长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)及miRNA在角膜缘干细胞分化中起关键作用，但具体机制尚不明确。我们前期研究发现lnc-TBC1D19-4在角膜缘干细胞中高表达，在异常分化的角膜缘干细胞中则低表达；而miR-146a在角膜缘干细胞中表达明显较低，在异常分化的角膜缘干细胞中则表达明显增加，且两者表达有明显负相关性。我们在前期研究的基础上提出假设：lnc-TBC1D19-4能够竞争性结合 miR-146a从而减少其对Notch通路抑制，维持角膜缘干细胞的正常功能。本研究从动物模型样本及体外培养细胞模型为出发点，以基因芯片及二代测序结果为基础，研究lncRNA在角膜缘干细胞分化中的作用，为探索lncRNA在角膜缘干细胞分化中作用机制及潜在临床应用提供新的思路。

使用干细胞的再生或修复治疗取决于在体外建立和优化干细胞培养体系，在移植的组织或者细胞中没有含量充足的干细胞，治疗性角膜缘移植或体外扩增角膜缘细胞移植可能会失败或者不能维持长期有效性。因此，建立体外有效扩增角膜上皮干细胞的体系具有重要临床意义。本研究的目的就是利用小分子化合物来尝试建立一个有效的体外扩增角膜上皮干细胞的体系，并探究其可能的机制。.转化生长因子β(TGF-β)信号通路是调节眼组织细胞行为的重要信号通路之一，以往对TGF-β信号通路调控功能的研究主要集中在眼组织纤维化和炎症反应中。然而，TGF-β在眼组织和眼外组织中，均显示出具有抑制上皮细胞生长的作用。由于TGF-β是一种在不同的环境下即能抑制也能刺激细胞增殖的双向调节因子，因此我们检测了抑制TGF-β受体I介导的信号通路对在体外无血清和无滋养层条件下培养的原代角膜上皮细胞（CECs）增殖和分化功能的影响。.我们从6-8周龄雌性C57BL/6小鼠的眼球中分离得到小鼠原代CECs，在成分确定的角质形成细胞无血清培养基(defined KSFM)中无滋养层培养。所有细胞被随机分为3组，在培养基中添加10 μM SB-431542（特异性TβR- I抑制剂）培养的CECs为SB-CECs组；在培养基中添加10 ng/ml SRI-011381（特异性TGFβ信号激动剂）培养的CECs为SRI-CECs组，培养基中未额外添加SB-431542或SRI-011381培养的CECs为对照CECs组。我们通过在光镜下观察比较各组CECs的生长速率和形态; 通过IF、WB、PCR、ALI实验、球体形成实验以及创伤愈合试验等检测了细胞的属性和干性。结果显示，SB-CECs组细胞传代稳定，持续扩增，扩增速度是对照CECs组细胞的3倍左右，并具有干细胞的各种功能。人角膜缘上皮细胞的初步试验结果和小鼠CECs一致。这些研究结果能够帮助推进CESCs/CEPCs的相关基础和临床研究。