外周血循环DNA中HBV重复整合宿主DNA位点用于肝癌诊断和预后的研究

Circulating free DNA (CfDNA) is becoming a hotbed for developing novel diagnosis and prognosis methods for human diseases. In cancer research, the major focuses are on mutations, epigenetic changes, loss of heterozygosity and changes in DNA integrity in cfDNAs. In hepatocellular carcinomas (HCC), HBV virus often integrates into host genomes, and these integrations have recurrent target genes. The integration of HBV into these recurrent genes could results in expression changes related to liver carcinogenesis, and could also serve as diagnostic methods for HCC. Recently, We have developed and pubished a novel method of library construction and a method of massive anchored parallel sequencing (MAPS), which results in the identification of 14 novel recurrent target genes for HBV integration. .Hereby, we propose a hypothesis that cfDNAs could harbor HBV recurrent target sites derived from their original HBV liver tumors. Our aims are: 1) to compare the HBV recurrent target sites in cfDNAs among normal individuals, HBV chronic carriers, liver cirrhosis patients, and HBV-related HCC patients; 2) to correlate HBV recurrent target sites in cfDNAs with different pathological stages of HCCs; 3) to compare changes in HBV recurrent target sites in cfDNAs before and after surgery of treatment of HCCs. We expect to develop a method of using HBV recurrent target sites in cfDNAs for HCC diagnosis, treatment response monitoring and prognosis, which would be quite valuable for reducing deaths caused by HCC in China.

血浆游离DNA(cfDNA)是最新开发诊断试剂和疾病预后的研究热点，研究集中在cfDNA的突变、表观遗传变化和DNA完整性等变化上。乙肝病毒常整合在宿主基因组中，整合又存在重复靶基因。靶基因与HBV整合后与肝癌的发生发展密切相关。课题组开发了新的文库构建方法和一种大规模锚定并行测序技术，对原发性肝癌组织中HBV整合位点进行研究，发现14个新的HBV重复整合靶基因。鉴此，提出假说：cfDNA含有原发癌细胞中HBV整合宿主DNA的重复整合位点。拟将：1）比较正常人、慢性乙肝病毒感染者、肝硬化病人和肝癌病人cfDNA中的HBV整合位点；2）比较不同病理分期肝癌病人cfDNA中的HBV整合位点；3）比较术前术后或治疗前后肝癌病人cfDNA中HBV整合位点。预期得到cfDNA中HBV整合宿主DNA重复整合位点作为肝癌辅助诊断和监测、疗效跟踪和预后判断的应用方法，对降低我国肝癌病人的死亡率有重要价值。

长期的乙肝病毒（HBV）感染可以引起一系列的肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝硬化以及肝癌。流行病学研究发现，HBV慢性感染与肝癌的发生发展存在因果关系。HBV基因整合是其致病的重要机制之一。血浆游离DNA(cfDNA) 是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA，是目前开发诊断试剂和疾病预后的研究热点。在癌症病人中，关于cfDNA的研究主要集中在原发癌症释放到cfDNA的突变、表观遗传变化和DNA完整性等变化。HBV 在肝组织（肝癌和癌旁组织）的整合具有重复性，即 HBV 整合存在重复靶基因，可作为分子标记物开发诊断试剂。本项目力图通过技术突破在分子层面上对肝癌的诊断和预后进行描述，为相关机制研究提供HBV整合位点变化信息。本项目针对慢乙肝、肝硬化、肝癌病人样本，开发建立了快速、廉价、多样本分析外周血游离DNA前处理手段和整合位点分析技术。在以上方法学研究基础上，本项目对比了慢乙肝、肝硬化、肝癌病人与正常人HBV整合位点的区别，发现正常人不存在HBV的整合，随着乙肝病毒在人体中的整合扩增，由慢性乙肝病毒感染转为肝硬化，检测到的HBV的病毒含量也随之增加，检测到一个或多个整合的HBV亚基因组片段。但病程发展到肝癌，HBV病毒含量反而降低，可能是肝癌克隆进化导致的，和我们以前的报道是一致的。通过荧光定量PCR，检测肝癌患者外周血血浆中HBV整合宿主DNA的重复整合位点，以课题组发现的20个重复整合靶基因为基础，在阳性肝癌组织DNA样本中进行验证实验，成功鉴定出5个重复整合靶基因（CYP2C8、PHACTR4、RAI1、LRP1B、TERT）的7个整合位点。同时通过对比检测肝癌组织中HBV的整合情况，我们发现cfDNA中的HBV整合可一定程度上反映HBV感染的发生进程。本项目研究证明了外周血中循环DNA可以检测到乙肝病毒在宿主细胞中的整合事件，表明检测外周血游离DNA中的HBV整合可一定程度上反映HBV的整合进程，与传统组织学检测相比，具有无创，快速，准确，持续性的优点，为研究外周血中循环DNA乙肝病毒在宿主细胞中的整合事件和肝癌进展和预后提供了一个无创的跟踪手段。