牛卵母细胞中抗肿瘤piRNA的发现及其作用机理研究

Exploring anti-tumor piRNA from bovine oocytes and the study on their action mechanism.It is a promising researching area to develop anti-tumor bioactive substances from animal resources. The applicant has found in previous research work that bovine oocyte extract can epigenetic reprogram H460 human lung cancer cells, and that the piRNAs traveling from extract into H460 cells play an important role in this process. These results suggest that the bovine oocyte extract piRNAs contain new anti-tumor active molecules, worthy of deep exploration. This project is aimmed to screen anti-tumor activity of the piRNAs traveling from extract into H460 cells, using in vitro and in vivo models. The mechanism of anti-tumor piRNA will be studied from cell biology, molecular biology and epigenetics. The project can not only find new rich resources for anti-tumor drug development, but also promote the fusion of animal science, oncology, and epigenetics, deeping the recognization of biology process.

切除和杀灭肿瘤细胞是肿瘤治疗的传统思路，效果有限；重编程肿瘤细胞旨在改造肿瘤细胞的恶性发育命运，切中要害；研发重编程肿瘤细胞的活性分子，意义重大。申请人在前期工作中首次发现：牛卵母细胞抽提物能对人肺癌H460细胞进行表观遗传重编程，抽提物中进入到H460细胞内的piRNA在此过程中发挥了重要作用。这提示：牛卵母细胞抽提物的piRNA中，蕴藏着新型抗肿瘤活性分子，值得深入研究。本项目拟将牛卵母细胞抽提物中能进入H460细胞的piRNA采用体外、体内模型进行抗肿瘤活性筛查，对具有抗肿瘤活性的piRNA，从细胞生物学、分子生物学和表观遗传学三个方面深入探究其作用机理。本项目若能顺利实施，不仅可以发现新的活性物质用于肿瘤治疗，减轻患者痛苦、延长患者寿命，更可能从源头上对肿瘤细胞进行重编程，彻底根除其对人类生命的危害。

本项目使用高通量测序技术从牛卵母细胞中鉴定了大量的piRNA分子，采用体内外模型筛选抗肿瘤活性分子，并探究了它们发挥作用的分子生物学与表观遗传学机制。结果1：piR-bta-28479有效抑制了人胃癌细胞AGS和BGC823的增殖能力、平板克隆形成能力、锚定非依赖性生长能力和侵袭能力，促进了癌细胞的凋亡，增加了G0/G1期细胞比例、降低了G2/M期细胞比例，显著抑制了人胃癌裸鼠移植瘤的生长；转录组测序、qPCR和Western blot 实验显示，piR-bta-28479可以有效下调胃癌细胞中COL12A1和胶原受体DDR2的表达，降低了DDR2对下游ERK及AKT信号通路的活化；基因组甲基化测序、亚硫酸氢盐测序和ChIP实验显示，piR-bta-28479升高了COL12A1和DDR2启动子区的DNA甲基化水平，上调了两基因启动子区组蛋白修饰H3K27me3的水平、下调了两基因启动子区组蛋白修饰H3K4me2的水平。结果2：piR-bta-7976有效抑制了人结肠癌细胞HCT116和HT29的增殖能力、平板克隆形成能力、锚定非依赖性生长能力和侵袭能力，促进了癌细胞的凋亡，增加了G0/G1期细胞比例、降低了S期和G2/M期细胞比例，显著抑制了人结肠癌裸鼠移植瘤的生长；使用我们自主研发的预测软件，预测了piR-bta-7976的靶基因；qPCR和Western blot 验证显示，piR-bta-7976下调了WNT5A的表达；ChRIP-qPCR实验显示piR-bta-7976在结肠癌细胞中直接与WNT5A的mRNA相结合。本研究从异种来源的小RNA分子中发现了抗肿瘤活性物质，并阐明其作用机理，为恶性肿瘤的治疗提供了新的药物来源，为研发抗肿瘤新药开辟了广阔领域。