缺氧对椎间盘代谢的影响及机制研究

随着人口老龄化与工作方式的改变，椎间盘退变性疾病发病率明显增加，但其发病机制仍不明确。缺氧可能在椎间盘代谢中起重要作用。本课题首先从器官与细胞水平研究缺氧对椎间盘纤维环与髓核形态、HIF-1α、HIF-2α、cited2、能量代谢相关基因GAPDH、GLUT-1与GLUT-3、血管形成相关基因VEGF、细胞外基质I型胶原、II型胶原与Aggrecan mRNA与蛋白的表达的影响；其次探讨HIF- cited2信号传导通路在缺氧条件下椎间盘代谢中的作用，最后通过基因转染技术探讨cited2与FOXO3a在纤维环细胞与髓核细胞中的作用。通过本实验试图阐明缺氧机制在椎间盘代谢中的作用，从而为椎间盘退变的防治开辟新思路与新途径。

首先，本项目探讨了体内HIF-1α及其靶基因 VEGF 对于椎间盘发育、退变的作用。发现在3个时间点，HIF-1αKO小鼠椎间盘NP/AF 退变评分和总分均明显高于WT小鼠；HIF-1αKO小鼠髓核中aggrecan、II型胶原的含量均低于WT小鼠；免疫组化提示HIF-1αKO小鼠II 型胶原、aggrecan、VEGF 的表达均明显低于WT小鼠；在各个时间点，HIF1-αKO小鼠髓核细胞凋亡率均明显高于WT小鼠。然后明确了低氧、HIF-1α及HIF-1α-VEGF 信号通路在髓核细胞凋亡机制中的作用。发现退变髓核细胞中HIF-1α和VEGF 的表达较正常髓核细胞明显降低，而细胞凋亡率明显升高，casepase 3、casepase 9 表达明显增高，bcl-2/bax 比值下降；在低氧条件下，正常和退变髓核细胞 HIF-1α、VEGF 表达明显升高，同时髓核细胞凋亡率下降，且casepase 3、casepase 9、bax等促凋亡相关蛋白表达明显下降，髓核细胞的退变相关蛋白表达也明显下降。经过DFO 处理的髓核细胞HIF-1α、VEGF 表达明显升高，细胞凋亡明显减少；髓核细胞经过 NAC处理以后HIF-1α、VEGF 表达降低，但髓核细胞的凋亡却随着NAC的浓度升高而降低。最后进一步研究了cited2 对于HIF-1α、VEGF 等表达的影响及其在髓核细胞凋亡中的作用。发现在退变髓核细胞中cited2 的表达明显高于正常髓核细胞，在低氧条件下，cited2的表达明显降低。通过建立cited2 siRNA 的慢病毒载体稳定转染髓核细胞中HIF-1α及VEGF的表达明显升高，casepase 3、casepase 9、bax 等促凋亡蛋白表达明显降低。得出了以下结论：1. 条件性敲除髓核细胞中的HIF-1α 可明显促进小鼠椎间盘退变的发生和发展；HIF-1α对于抑制髓核细胞凋亡，维持髓核细胞的数量和功能的稳定，调节细胞外基质的稳定至关重要，而这种作用可能和 HIF-1α及HIF-1α依赖性的靶基因VEGF 的表达密切相关。2. 低氧可以通过HIF-1α-VEGF 信号途径抑制髓核细胞的凋亡，并可能保护椎间盘避免退变。3. DFO 可以通过HIF-1α-VEGF 信号途径而抑制髓核细胞的凋亡。4. cited2 与椎间盘退变关系密切。