基于细胞膜结合成分/细胞内药效成分的二仙汤抗骨质疏松等效成分群及其网络药理学研究

Er-Xian Decoction (EXD) has been broadly employed to regulating bone metabolism and improving bone mineral density of patients with osteoporosis. We successfully isolated several anti-osteoporotic components from single herbs of EXD and investigated their targets and pathways. However, there are limited researches about the bioactive equivalence of combinatorial components from EXD and their action mechanisms. In the present project, cell membrane-binding components will be achieved by cell membrane chromatography-liquid chromatography while intracellular effective substances will be analyzed by high-efficiency sample pretreatment-liquid chromatography. The above components will compose a comprehensive pharmacological active components set. Then, we will ‘capture/remove-add/remix’ these compounds and evaluate their bioactivities by cathepsin K, osteoblast and osteoclast models in order to construct bioactive equivalent combinatorial components set (BECC). Finally, network pharmacology will be utilized to predict targets and pathways of BECC. This project will answer the key question of which are real bioactive components of EXD, and provide a promising approach to discover BECC from herbal medicines.

二仙汤是临床治疗骨质疏松症的常用方剂，研究显示：二仙汤能有效促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞活性，显著提高骨密度。课题组前期研究了二仙汤中单味药的有效成分及其作用靶点，但对于能代表原方药效的等效成分群及其作用机制尚不清楚。本课题旨在研究二仙汤的等效成分群及其作用机制，以细胞膜色谱-液相色谱法筛选成骨/破骨细胞膜结合成分，以无损耗样品处理-液相色谱法得到成骨/破骨细胞内药效成分，综合两者建立整体药效成分群，继而通过“捕获/剔除-添加/复配”精选成分，用组织蛋白酶K、成骨细胞和破骨细胞模型进行药效评价，与原方进行等效性比较后，确定二仙汤的抗骨质疏松等效成分群，最后采用网络药理学预测等效成分群的作用靶点和相关通路，从分子水平阐释中药多成分多靶点协同整合机制，贯穿“中药复方-药效成分群-等效成分群-作用机制”的全链条，为促进成分清楚、质量可控、机制明确的现代中药研究提供借鉴。

首先以成骨细胞作为细胞膜来源，制备成骨细胞膜色谱-液相色谱-QTOF-MS分析体系，继而创建毛细管细胞膜-液相色谱-QTOF-MS分析体系，筛选二仙汤中与破骨/成骨细胞膜的结合成分。然后采用细胞萃取技术，明确二仙汤中能够进入细胞模型的成分集。采用成骨细胞、破骨细胞和氧化应激病理细胞模型药效研究，结合制备色谱制备了二仙汤等效成分群、残余成分群和全成分群。细胞模型、骨质疏松斑马鱼模型和骨质疏松大鼠模型确定二仙汤全成分群与等效成分群可以显著修复成骨细胞模型的氧化损伤，包括提高细胞活性、碱性磷酸酶活性、GSH-px水平，提高骨质疏松斑马鱼头骨面积和光密度，提高骨质疏松大鼠血清中的E2、BMP2、SOD、GSH-px水平，并且降低NO和MDA水平，能显著降低去卵巢大鼠的骨钙素，并且提高骨密度。由此确定二仙汤等效成分群包括13个抗骨质疏松活性成分。网络药理学研究发现二仙汤干预PI3K-Akt信号通路最为显著。能够调控最多靶点的前6个化合物有：淫羊藿苷、仙茅苷、芒果苷、阿魏酸、小檗碱、水晶兰苷。结果表明，二仙汤能够激活TNF-α干预成骨细胞模型中的PI3K-AKT信号通路，进而促进Nrf2核转移，上调Nrf2下游抗氧化因子HO-1水平，发挥抗氧化应激的作用，最终通过上调caspase-3水平，达到抗凋亡作用。二仙汤君药仙茅主要靶标和10种相应化合物与内分泌和其他因子调节的钙重吸收，类固醇激素的生物合成和代谢途径有关。二仙汤中巴戟天主要成分水晶兰苷能够诱导细胞自噬，保护氧化应激损伤的成骨细胞。以上结果表明，本课题得到的二仙汤活性成分群可能是骨质疏松症治疗的候选药物。