水稻OsmiR396通过调控类黄酮合成介导对褐飞虱的抗性的分子机理研究

Brown Planthopper (BPH) is a rice-specific pest, and remains to be a serious threat to rice high yield and high quality breeding. To enhance durable resistance through gene aggregation is a natural trend in breeding, so that more resistant genes need to be excavated and aggregated. Rapid advent of high throughput genomic sequencing techniques and bioinformatics methods indicates that the function of miRNA is far more powerful than our imagines. And since miRNAs function through targeting many targets, which encode transcription factors, they possess the character of natural aggregation. Study the mechanism of miRNA in BPH resistance is premise for exploitation of miRNA in BPH resistance. Based on this thought, we firstly identified BPH responsive OsmiR396 through miRNA-seq. And preliminary study revealed that OsmiR396 could negatively regulate the resistance to BPH and the content of flavonoid, and application of flavonoid could obviously improve the rice plants’ resistance to BPH. And in the genetic plants of miR396, expression of many flavonoid biosynthesis genes was influenced. Flavonoid biosynthesis genes might function downstream of miR396 to regulate BPH resistance. Based on these preliminary studies, we planned to study the signal transduction pathway and molecular mechanism of OsmiR396 mediating BPH resistance through regulation of flavonoid biosynthesis, so that provide new theory and gene resources for BPH resistance breeding.

褐飞虱是专一性取食水稻的害虫，一直是水稻高产优质育种的重大威胁。通过基因聚合增强持久抗性是水稻抗虫育种的必然趋势。为此，需深度挖掘新的抗虫基因，进行聚合。不断发展的深度测序和生物信息学技术暗示miRNA的调控作用可能远远超过我们的预期。miRNA由于调控诸多转录因子编码基因而具备天然聚合效应。深入挖掘miRNA的抗虫机制是开发其巨大抗虫潜力的前提。因此，本研究通过miRNA-seq鉴定到响应褐飞虱取食的OsmiR396。初步研究表明OsmiR396能够同时负调控水稻抗褐飞虱和类黄酮的含量，外源施加类黄酮能够明显提高水稻对褐飞虱的抗性。在OsmiR396的遗传材料中，多个类黄酮合成基因的表达受到明显影响，它们可能位于OsmiR396的下游调控对褐飞虱的抗性。基于此，本申请拟深入研究OsmiR396通过调控类黄酮合成介导抗褐飞虱的信号传导途径和分子机制，为抗褐飞虱育种提供新的理论和基因资源。

褐飞虱是专门取食水稻的刺吸式害虫，其造成的危害在近几年跃升为各种病虫害的首位。传统的过度依赖农药的防治方法，不仅造成了环境污染，而且催生褐飞虱的耐药性，从而易造成再度猖獗。根据害虫综合治理的理念，从水稻自身挖掘抗性基因，才是对褐飞虱进行有效防治的长效绿色措施。miRNA在植物的发育和生理等方面，都发挥着重要的作用；在介导植物和环境的互作中，miRNA越来越显示出其强大作用，而且成为作物育种非常有潜力的靶标基因。据此推测miRNA可能介导水稻和褐飞虱的相互作用。我们通过基因组水平的筛选，检测到若干miRNA受到褐飞虱取食的影响，miR396是其中之一。通过构建miR396竞争性功能下调的MIM396转基因植株以及超表达转基因植株进行的遗传功能研究表明，miR396负调控水稻抗褐飞虱，同时负调控水稻中的类黄酮含量。同时，靶基因之一，OsGRF8正调控水稻抗褐飞虱和类黄酮含量。以类黄酮处理水稻会提升水稻对褐飞虱的抗性；重要的是，天然水稻品种中，类黄酮的含量和品种抗性之间，也存在着明显的线性关系。对类黄酮合成基因进行分析，揭示出OsGRF8能够通过直接结合到OsF3H基因的启动子，对其进行转录调控。通过构建超表达转基因植株F3HOE和RNAi转基因植株F3HR，对OsF3H进行遗传功能研究表明，OsF3H正调控水稻抗褐飞虱和类黄酮含量。将F3HR植株和MIM396植株进行杂交，结果显示F3HR植株能够回复MIM396植株对褐飞虱的抗性和类黄酮的含量。说明miR396和OsF3H位于同一个遗传通路上介导对褐飞虱的调控。因此，我们鉴定和证明了miR396-OsGRF8-OsF3H的遗传信号传导途径，能够通过影响类黄酮的合成，介导水稻抗褐飞虱。同时，我们也证明了miR396和OsF3H调控类黄酮含量这一功能在不同物种中的保守性。通过本研究，我们首次证明了miRNA可以介导水稻抗褐飞虱，从而一方面提供了抗褐飞虱的新基因种类，另一方面，对miRNA的功能进行了进一步的拓宽。miRNA是巨大的基因资源宝库，后续研究中，可以继续挖掘其它的调控水稻抗褐飞虱的miRNA并研究其机理，为水稻抗褐飞虱育种提供新的基因资源和理论指导。