H1N1流感病毒血凝素异嗜性抗原表位分析及突变研究

Influenza A (H1N1) is caused by the H1N1 influenza virus in acute respiratory infections. A flu vaccine inoculation is the primary means of preventing influenza. A small number of serious adverse reactions caused by H1N1 vaccine making people worry, its mechanism is unclear. Preliminary studies by our group found that three hemagglutinin (HA) monoclonal antibodies of H1N1 influenza virus reaction with human multiple tissue antigens, suggesting that such antibodies may be related to few serious adverse reaction after a flu vaccine vaccination. This topic is intended to be three monoclonal antibodies of H1N1 influenza virus HA with resistance to host activity as research tools, firstly, cloning light and heavy chain variable region of three antibody genes by means of genetic engineering, predicting the amino acid sites of the HA monoclonal antibody binding with HA protein by computer simulations; secondly, knockout the HA heterophil antigen epitope by PCR mutations, eukaryotic expression of different HA mutant protein; Finally, expressing the HA mutated protein by eukaryotic expression system, to determing whether removal of heterophil epitope affect neutralizing epitopes and hemagglutinin epitope. The completion of the project, we can determine the HA epitope heterophilic amino acid sites of H1N1 influenza virus, this research may lay the research foundation for the development of safe and effective H1N1 influenza vaccine, and may provide new ideas for studying the safety of the other vaccines.

甲型H1N1流感是一种急性呼吸道传染病，接种疫苗是其主要预防手段。但甲流疫苗接种后所引起的少数严重不良反应增加了人们对其安全性的担心，目前其不良反应的发生机制仍不清楚。我们前期研究发现3株H1N1流感病毒血凝素（HA）单克隆抗体可与人体多种组织抗原发生反应，提示HA和人体组织存在共同抗原表位（异嗜性抗原），推测其可能与疫苗的不良反应有关。本课题拟以这3株单抗为研究对象，首先采用基因工程手段克隆其轻重链可变区基因并测序，利用计算机模拟预测HA与单抗结合的氨基酸位点；然后通过点突变技术改造HA的异嗜性表位，并对HA突变体进行真核表达；最后对突变体的中和、血凝及异嗜性表位进行鉴定，确定去除异嗜性表位对HA的中和表位和血凝表位的影响。本项目的完成，可确定H1N1流感病毒HA异嗜性表位的氨基酸位点，为开发安全、高效、基于HA蛋白突变体的H1N1流感疫苗奠定研究基础，并为其它疫苗的安全性研究提供思路。

流感是一种急性呼吸道传染病，其中以甲型H1N1流感的危害最为严重。目前预防流感的主要手段是接种疫苗，但接种疫苗的不良反应引起了人们对安全性的担忧，但目前关于甲流疫苗接种后所引起不良反应的机制仍不清楚。本课题首先从临床病例入手，收集并分析了87份陕西省2009年甲型H1N1流感重症及危重症病例的血常规参数，分别分重症、危重症及死亡三组，对其淋巴细胞、红细胞和血小板三个指标进行分析，其中在死亡病例中三者中低于正常值的比例均为81.8%, 66.7% 和 76.9%，危重症病例中三者低于正常值的比例分别为80%, 50% 和37.5%，提示H1N1流感病毒HA与人体多种组织存在共同抗原表位。为进一步分析甲流疫苗的不良反应可能的作用机制，我们制备了67株针对甲型H1N1的血凝素HA的小鼠单克隆抗体，对其特异性和交叉性分析，提示有3株异嗜性HA抗体。ELISA结果显示其与人红细胞、血红蛋白、白细胞和血小板均有不同程度的交叉反应；免疫组化结果同时也证实3株HA抗体与小鼠的肺组织有结合。我们以分泌3株HA抗体的杂交瘤细胞为研究对象，对其抗体的轻链和重链可变区基因克隆并测序，结果显示3株抗体中A1-10和H1-15抗体序列完全一致。利用生物信息学技术模拟预测HA与单抗结合的氨基酸位点。通过阻断ELISA结果进一步验证A1-10与H1-15的抗原表位作用特点相一致。该研究基于单克隆抗体技术，不仅产生了具有保护活性的单克隆抗体，更重要的是发现流感病毒疫苗免疫后机体产生了抗自身抗原的抗体，对这种产生非特异结合的抗体可能的结合位点的深入研究，并结合临床病例的相关参数，两者结合分析可为进一步阐明流感疫苗产生罕见的严重副作用提供新的思路，并可完善其它疫苗的安全性研究的策略。