C末端Src激酶（Csk）调控足细胞nephrin磷酸化的作用及机制

Nephrin is an important structural and signal transduction molecule located in slit diaphragm of podocyte.The change of nephrin phosphorylation contributes to the survival and cytoskeleton reorganization of podocyte. But, the mechanism of nephrin phosphorylation regulation is still unclear. Fyn is the key kinase that phosphorylates nephrin intracellular domain. C-terminal Src kinase (Csk) is specific negative regulatory factor of Fyn. This project proposed to further explore the role and molecular mechanisms of Csk involved in the regulation of nephrin phosphorylation in normal or injury podocyte state. By angiotensin II stimulation of cultured podocytes, we will evaluate the impact of angiotensin II on the nephrin phosphorylation and podocyte injury, and observe the expression and distribution of Csk and the interactions with caveolin-1 and Fyn. Through the down-regulation of Csk by siRNA, and co-transfection with Csk mutant plasmids/Fyn C terminal Try 530 mutant plasmids and nephrin plasmids, we will analyze the characteristics of nephrin phosphorylation regulated by Csk, and further confirm the role of Csk in the regulation of nephrin phosphorylation, and provide a new theoretical basis for the effective prevention of podocyte injury.

Nephrin是定位于足细胞裂隙膜的重要结构蛋白和信号转导分子，其磷酸化改变在调节足细胞存活及骨架蛋白重组中起重要作用，但nephrin磷酸化调控机制仍不清楚。Fyn激酶是磷酸化nephrin胞内段的关键激酶，C末端Src激酶（Csk）是 Fyn的特异性负性调控因子。本项目拟探讨Csk在足细胞正常及损伤状态下参与调控nephrin磷酸化改变的作用及分子机制。通过血管紧张素Ⅱ输注大鼠模型及培养足细胞，评价nephrin磷酸化及足细胞损伤，观察Csk在足细胞表达、分布及与caveolin-1、Fyn蛋白间相互作用特点；通过siRNA下调足细胞Csk表达和在HEK293T细胞共转染Csk突变质粒/Fyn C末端Try530突变质粒和nephrin表达质粒，分析Csk调控nephrin磷酸化改变的分子机制，明确Csk在调控足细胞nephrin磷酸化中的作用，为有效防治足细胞损伤提供新的理论依据。

蛋白尿是肾小球疾病常见的临床表现，也是造成肾小球疾病进展、肾小球硬化的重要独立危险因素。足细胞是构成肾小球滤过屏障最重要的固有细胞成分，贴附于肾小球基底膜的最外侧，相邻足突间形成特异性分子筛结构裂隙膜（slit diaphragm, SD）。足细胞损伤、SD结构破坏是引起蛋白尿及肾小球硬化的重要发病机制。Nephrin是特异表达于足细胞的重要结构蛋白和信号分子，其胞外段通过嗜同性或嗜异性结合能力与相邻nephrin分子或与nephrin同源的neph1分子相互交联形成SD结构；其胞内段含有进化保守的酪氨酸残基，具有重要的信号转导功能。在许多足细胞损伤模型中研究发现nephrin表达、分布及磷酸化水平发生改变将直接影响足细胞生物学功能。已知Src 激酶家族成员Fyn是磷酸化nephrin胞内段酪氨酸残基的关键激酶，而C 末端Src 激酶（Csk）是Fyn 的特异性负性调控因子。本项目研究内容包括：1.通过建立AngII诱导的足细胞损伤模型（体内和体外）观察Csk在足细胞中的表达及分布变化、nephrin磷酸化及Fyn 激酶活性变化，评价Csk 与nephrin、脂筏蛋白caveolin-1、Fyn 激酶等蛋白间相互作用的特点；2.通过干扰RNA技术人为调控Csk在足细胞中的表达，进一步评价Csk在nephrin磷酸化调控及足细胞损伤中的作用。研究结果发现Csk主要在足细胞胞浆中游离表达；AngII刺激足细胞后，Csk表达上调并向足细胞胞膜移动，与caveolin-1、Fyn激酶、nephrin形成蛋白复合体，Fyn激酶活性降低，nephrin磷酸化水平下降，足细胞发生凋亡、原有骨架结构破坏；Csk干扰RNA转染足细胞后下调Csk表达50%-60%；相较AngII刺激组，Fyn激酶活性明显增加(p<0.05)，nephrin磷酸化水平明显升高(p<0.05)，足细胞凋亡率明显下降(p<0.05)。本项目研究结果证实Csk参与调控生理及病理状态下nephrin胞内段磷酸化改变，进而影响足细胞生物学功能；进一步验证nephrin磷酸化或信号转导在维持足细胞正常生物学功能中的重要作用，为保护足细胞治疗策略提供了新的理论依据。