基于RNA-Seq技术以巨噬细胞极化相关的信号通路为靶点探讨脊髓损伤治疗的策略

Our previous study has shown that classically activated pro-inflammatory (M1) and alternatively activated anti-inflammatory (M2) macrophages populate the local microenvironment after spinal cord injury (SCI). The former type is neurotoxic while the latter has positive effects on neuroregeneration. However, a week after SCI, M1 cells are dominant, while the M2 cells are very rare. We also confirmed that it could increase the fraction of M2 cells, prolong their residence time and play a neuroprotective role by adoptive immunotherapy. However, this is difficult to apply in a clinical setting, given that it requires time to culture cells and will be outside the time window for the early treatment of SCI. For this reason, it will be a promising strategy for the SCI repair by screening the small molecule drugs targeting M1/M2 cells. It is very important for drug screening by elucidating the ligands and their signal transduction pathway associated with macrophage differentiation in the injured local microenvironment. However, it has never been studied profoundly and systematically. Thus, in the present study, the changes in gene expression at the transcriptional level in the injury spinal cord at different time points after SCI and M2 cell adoptive transfer will be identified by RNA-Seq technology. Then, the signal pathways will be constructed based on the key genes related to M1 and M2 polarization. The key molecules and signaling pathways will be further clarified and considered to be targets for pharmacologic intervention. These explorations will provide new theoretical and experimental basis for the clinical treatment of SCI.

我们前期研究证实，在脊髓损伤（SCI）局部微环境中，早期可检测到神经损害性的M1型巨噬细胞（M1细胞）和神经保护性的M2型巨噬细胞（M2细胞），但损伤一周后M1细胞占绝对优势，而M2细胞比例则很少。并首次证实采用过继免疫可以提高损伤局部M2细胞的比例，发挥神经保护作用。但是，该方法需培养细胞，有滞后性，会错过SCI早期治疗的时间窗。因此，以M1/M2细胞为靶点，寻找适合临床应用的小分子药物，才是治疗SCI的可行性策略。在SCI局部，与巨噬细胞分化相关的配体及其信号级联反应，对于药物的筛选具有重要价值，但缺少系统研究。因此，本课题拟采用RNA-Seq技术，分析SCI不同时间点以及M2细胞过继回输后，损伤局部基因在转录水平表达的变化，然后针对与M1、M2细胞分化相关的关键基因进行信号通路构建，进一步筛选、鉴定关键分子和信号通路，作为药物干预的靶点，为SCI的临床治疗提供新的理论和实验依据。

我们前期研究证实，采用过继免疫可以提高脊髓损伤（SCI）局部M2细胞的比例，发挥神经保护作用。但是，该方法需培养细胞，会错过SCI早期治疗的时间窗。因此，本课题拟采用RNA-Seq技术，分析SCI不同时间点以及M2细胞过继回输后，损伤局部基因在转录水平表达的变化，以期进一步筛选、鉴定关键分子和信号通路，作为药物干预的靶点，为SCI的临床治疗提供新的理论和实验依据。具体成果如下：.1. 获得了大鼠SCI不同时间点损伤局部转录组的分析数据，发现了一些重要的差异基因，如Socs3、Il17、Tnf、AIM2、Nlrp1、Nlrp3、Casp1、Il1b、Hk3等。进一步分析不仅证实了一些已报道的与SCI相关的信号通路，也发现了一些新的信号通路。这为我们进一步理解SCI的病理机制、探讨治疗策略提供了重要线索。在此基础上，又对感兴趣的分子，如IFITM1、HK3、Cp、AIM2在mRNA和蛋白水平进行了系统地探讨，不仅证明了它们可以作为反应SCI炎症程度和预后的标志物，还提示AIM2及其相关的炎症小体是潜在的治疗靶点；.2. 以M2细胞过继免疫为干预手段，对损伤的脊髓进行了RNA-Seq分析。发现M2过继免疫对损伤局部微环境中基因的表达和信号通路产生了一定的影响。其中包括几种与炎症小体相关的分子（NLRP1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1b、IL-18等）。这提示下一步可以以炎症小体为靶点探寻SCI早期治疗的药物；.3. 采用炎症小体共用接头蛋白ASC寡聚化的抑制剂CRID3，我们发现它能够降低损伤局部M1细胞亚群的比例，在mRNA和蛋白质水平影响炎性、凋亡等相关因子的表达。此外，组织学和病理学的检测表明它也可以提供神经保护作用；.4. 在为期四年的研究过程中，有11名研究生和10名科研人员参与本课题的研究工作，参加国际会议和全国会议各一次，在中文期刊发表研究论文2篇，在SCI期刊发表论文12篇。综上所述，我们圆满完成了全部的研究计划，在取得了预期成果的基础上又提出了新的问题，为下一阶段的研究工作打下了扎实的基础。