嗜热烟曲霉HBFH5甘露聚糖酶解关键酶系解析及协同机制

The research on the mechanism of thermophilic mannan-degrading enzymes is not only a hotspot of food enzymology, but also is the key to improve the efficiency and quality of mannan oligosaccharide. Therefore, it is a very important that research on the molecular mechanism of thermophilic mannan-degrading enzymes. We have obtained thermophilic fungus，Aspergillus fumigatus HBFH5，which expressed Mannanase, Chitinase , Glucose oxidase gene and other gene. However, It has not been knew that the molecular mechanism of thermophilic mannan-degrading enzymes. In this study, we use the proteomics, qPCR and bioinformatics technology to analyze the composition of mannan-degrading enzymes in Aspergillus fumigatus HBFH5. Using the expression, immunoprecipitation and ITC analysis technology, reveals the molecular mechanisms of the key mannan-degrading enzymes. This research reveal on the molecular mechanism of mannanase-degrading enzyme . Not only that, but also provide a new strategy of production mannose oligosaccharide.

嗜热甘露聚糖降解酶系的作用机制研究，既是食品酶学中的热点，也是提高甘露寡糖制备效率和质量的关键，因此开展嗜热甘露聚糖降解酶系组成及分子作用机制的研究具有重要的理论和现实意义。申请人前期对嗜热真菌A.fumHBFH5在甘露聚糖作为唯一碳源下的转录组学分析中发现，该菌除进行甘露聚糖酶基因表达外，还有大量未知基因及几丁质酶、葡萄糖氧化酶等基因表达，而甘露聚糖降解分子机制也有待阐明。本项目以嗜热烟曲霉HBFH5为研究对象，利用蛋白质组学、qPCR鉴定和生物信息等技术，分析嗜热烟曲霉HBFH5中的甘露聚糖降解酶的组成；结合基因异源表达、免疫共沉淀和ITC分析等技术，探究关键酶之间的协同作用机制。上述研究结果将有助于理性的进行甘露聚糖酶解方案的设计。本项目的实施不仅可以丰富甘露寡糖制备酶系理论，也可为寻找新的酶法制备甘露寡糖策略提供一定的理论指导。

魔芋寡糖（konjac oligosaccharides，KOS）是一种功能性低聚糖，在食品、饲料和医药等行业有广泛的应用价值。生物酶解技术在魔芋寡糖的制备方法中最具前景，而降解酶系组成及作用机制还有待阐明。为此，本研究以嗜热烟曲霉HBFH5为研究对象，分析嗜热真菌菌株在魔芋葡甘聚糖降解过程中降解酶系组成。利用转录组和蛋白组学技术发现A.fumigatus HBHF5在魔芋葡甘聚糖作为唯一碳源条件下，差异表达的基因数为106个，其中碳水化合物酶（CAZymes），如纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、糖苷酶、膨胀素蛋白（Swol）及纤维二糖脱氢酶等56个基因上调表达。通过对13个关键基因进行异源表达及酶学特性的表征发现，甘露聚糖酶AfMan5B与其他不同酶组合表现出明显的差异。膨胀素AfSwol、单宁酶AfTan、纤维素酶AfEn、多聚半乳糖醛酸酶AfPGL、纤维素酶AfCel5A和AfCel5B均具有促进甘露聚糖酶AfMan5B的酶解效率。其中，最为明显的是纤维素酶AfCel5B，协同系数为约300%；葡聚糖酶AfEn能够提升15-30%降解能力；多聚半乳糖醛酸酶AfPGL中也有所体现，顺序作用与共同作用并未表现出明显的差异，能够提升12-24%降解能力。除上述外，本研究发现膨胀素有利于甘露聚糖酶AfMan5B降解魔芋葡甘聚糖，能够使其活性增加10-30%，这说明膨胀素作为大分子聚糖结构的疏松蛋白具有普遍意义。单宁酶AfTan同样表现出了协同促进甘露聚糖酶AfMan5B降解魔芋葡甘聚糖的作用能够使其活性增加26-69%。本项目的实施不仅可以丰富甘露寡糖制备酶系理论，也为酶法制备甘露寡糖策略提供了一定的理论指导。