杉木雌配子体“微环境”调控合子胚发育的蛋白质组研究

杉木是我国重要的用材树种，有着重要的经济和生态价值。但由于经遗产改良的种子短缺限制了苗木的供应。通过体胚发生获取优质的种苗是保障林业可持续发展的重要手段。但传统的体胚发生过程是冗长而繁琐的。本研究是基于体细胞胚胎发生重演了合子胚形态发生的进程这一基本理论为基础。拟研究合子胚和包裹合子胚的雌配子为研究对象，在蛋白质水平上研究"天然培养基"- - 雌配子体及合子胚发育过程的蛋白质组特征，试图了解雌配子体在调控胚胎发育过程中的作用以及胚胎发育机制，解析雌配子体调控的代谢途径及合子胚发育的重要标记性分子事件。本研究不仅为通过模拟合子胚发育过程来指导木本植物体细胞胚胎发生提供理论依据，而且有助于了解裸子植物种子的发育的分子机理。

由于种子的产量、质量及扦插育苗等技术瓶颈问题，无法满足生产上日益增长的良种需求。而体细胞胚胎发生和植株再生技术具有种苗繁殖速度快、数量多的显著优点而蕴涵着巨大的潜力，为实现杉木良种的大规模化生产提供了重要的手段。以自然条件下的发育的裸子植物胚胎，研究其发育过程的蛋白质的表达特征，将有助有了解林木种子胚发育的分子机制。.本研究首先对DIGE系统进行了评估，主要针对三方面：2-D的重复性评价，标记实验和样品标记效果，得到了较为理想的实验结果。本研究用DIGE研究了种子发育六个时期的蛋白质表达变化即第1和第2阶段为裂生多胚阶段，第3和第4阶段为优势胚阶段，第5阶段为柱状胚阶段，第6阶段为子叶胚前期阶段。试验中采用one-way ANOVA (P<0.01)统计分析方法，Threshold mode设为2.0倍，进行差异分析。将到的136个表达显著差异的蛋白质点进行LC-MS/MS和MALDI-TOF分析，共鉴定到71个蛋白质。其中，利用LC-MS/MS鉴定了59个蛋白质点，MALDI-TOF鉴定了12个蛋白质点，其余的蛋白质在数据库中没有匹配。这些蛋白质主要参与碳代谢、硫代谢、能量代谢、蛋白质的合成和稳态调控、蛋白质的积累、胚胎发育过程中的光合作用、胚胎发育、蛋白质的翻译、细胞凋亡过程、逆境胁迫、细胞骨架建成及未知功能蛋白。根据蛋白质的表达变化推测与细胞凋亡相关的蛋白质有Poly [ADP-ribose] polymerase 1，Transglutaminases和similar to cysteine proteinase (RD21A) / thiol protease，在多胚到优势胚阶段，胚柄的消失及雌胚子体溶蚀腔的一狭窄的单细胞层的降解方面有着重要的调控作用。实验中所鉴定的ELM2 domain-containing protein / PHD finger family protein表明染色质的重塑可能对胚发育过程中的形态建成有着重要的调控作用。碳代谢是杉木种子发育早期较活跃的过程，而硫代谢是种子发育后期较活跃的代谢过程，其为种子成熟提供了条件。