白及止血作用的药效物质基础与作用机制研究

Uncontrolled bleeding is one of the leading causes of death, while effective hemostatis can reduce the mortality. Development of efficacious hemostatic agents has been the urgent need for the treatment of bleeding diseases. Plant-based hemostatic drugs showed potential in clinical therapy for their advantages of multi-channel and multi-target effects over other drugs. Although Bletilla striata is widely used by the Guizhou people to treat various types of bleeding diseases and more than 20 registered drugs approved by SFDA has used it as a hemostatic ingredient, its effective compounds (except polysaccharides) and mechanism of action are still unclear, which retards the deep exploitation of this plant. Our previous investigations showed that p-Hydroxybenzyl alcohol ester polyglycosides were very active as hemostatic agents, with potency of 1 mg/mL of each chemical entity comparable to that of 10 mg/mL of Yunnan Baiyao. In the current project, various pharmacological and chemical isolation techniques will be employed to evaluate and isolate the chemical constituents present in the active fractions for effective hemostatic agents. The mechanism of actions of the active fractions and their representative effective compounds will then be studied in a multi-way manner, which will pave the way for the understanding of the hemostatic mechanism of Bletilla striata. Efficacious hemostatic chemical entities will also be expected.

无控制出血是创伤死亡的主要原因，有效止血成为降低早期创伤死亡率的关键手段，开发高效止血药物成为出血病症救治的迫切需要。植物来源的止血药物在临床出血性疾病防治中体现出多环节、多靶点作用，具有独特优势和发展潜力。白及在贵州民间广泛用于治疗出血性疾病，已有二十多个以白及为主药的上市产品。但现有研究除了白及多糖被证明有止血作用外，其它作用物质及作用机制尚不清楚，已成为深层次开发的技术瓶颈。课题组对白及化学成分、药理作用、有效组分等进行了研究，发现对羟基苄醇酯的多糖苷类化合物具有较强的止血活性（在1 mg/mL的浓度下与10 mg/mL 云南白药相当）。本课题将以白及有效组分为研究对象，通过高速逆流色谱、凝胶色谱等有效分离手段开展化学成分及有效组分体内外止血活性和作用机制研究，探讨白及止血药效物质及其作用机制，为白及止血活性较好的药效物质及单体化合物或前体药物的深度开发提供科学依据。

无控制出血是人类创伤后死亡的主要原因之一，开发高效简便的止血药物已成为各类出血病症救治的迫切需要。本研究使用95%乙醇提取白及，并用不同极性溶剂洗脱获得了5种组分，通过小鼠出血时间的测定确定其中80%乙醇洗脱段（组分C）与多糖组分E为有效组分。该2种组分在大鼠肺、胃出血模型中均能改善肺间质出血，肺泡壁增厚、胃充血症及炎细胞浸润等病变情况，提示白及有效组分可调节血小板和纤溶系统，使血小板最大聚集率恢复正常，平衡t-PA与PAI-1两者的比值，并改善肺、胃组织的病理变化，从而发挥止血作用。通过对含量丰富的组分C进行分离，获得了24个化合物，其中新化合物2个（B4, B12），9个化合物为该属植物中首次分离得到。进一步通过UHPLC-ESI-Q-TOF MS分析确认B1、B5、B6、B12、B13、B14、B15、B17、B19、B20、B21、B23为组分C的主要化学成分，使用ADP、THR诱导的血小板聚集实验和小鼠凝血时间确定了B1、B5、B6、B12、B14、B15、B17、B20、B23可显著增加血小板聚集作用、缩短肝素化小鼠凝血时间。机制研究表明，组分C灌胃给药后可刺激大鼠血小板膜糖蛋白CD62P的活化，使其发生形变并伸出长长的伪足而聚集成团，进而使二磷酸腺苷（ADP）诱导血小板聚集作用增强；促使凝血共同途径中THR的生成增加，凝血酶时间（TT）缩短，加速血液的凝固；并通过增加纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）含量，抑制纤溶酶原转化为纤溶酶，从而抑制纤溶酶将纤维蛋白转化为纤维蛋白降解产物D-二聚体（D-D）；同时使血液黏度增加，血流速度变慢而发挥止血作用。作为组分C的主要成分，B14可显著增加血小板P-选择素（P-S）和血栓素B2（TXB2）的含量，抑制6-酮基前列腺素F1α（6-keto-PGF1a）的生成，缩短小鼠血浆中TT值，降低纤溶酶（PL）含量，缩短肝素化小鼠BT、CT值而发挥止血作用。最后，采用UPLC (PDA)建立了白及的多指标含量测定方法，为白及药材的质量控制提供了基础。