苦荞R2R3-MYB SG7类转录因子基因功能分析

R2R3-MYB SG7 transcription factors play important roles in the regulation of the biosynthesis of flavonls in Arabidopsis thaliana.There are three members including MYB11,MYB111 and MYB12 in R2R3-MYB SG7 family. F.tartarcium contains highly active flavonls such as rutin.In our perious work, the content of flavonls in different cultivars of F.tartarcium varied to a great extent, and treatments with exogenous physiological and biochemical factors such as UV-C, Salicylic Acid and Phenylalanine afftected the the rutin content and the expression level of key genes in the flavonl biosynthesis pathway. In order to understand the regulation mechanism of flavol biosynthesis in F.tartarcium, we propose here to clone and study the functions of the genes of R2R3-MYB SG7 transcription factors:(1) Screening F.tartarcium EMS mutagenesis library for the mutants of R2R3 MYB-SG7 transcription factors (myb11,myb11,myb12) by keypoint technonlogies;Comparative analysis the content of flavonls and the expression level of structual genes,then the target gene and regulatory aera will be idetified.(2) By electrophoretic mobility shift assay（EMSA）could be identified the interaction between promotor of target sequence in R2R3 MYB SG7 transcription factors and regulatory aera.Yeast one-hybrid technology to understand the regulation mechanism of R2R3 MYB SG7 transcription factors in flavonols biosynthesis.The results dicovered the regulatory mechnism of R2R3-MYB SG7 transcription factors,thus providing the scientific basis for the molecular breeding of F.tartarcium.

R2R3-MYB SG7类转录因子家族包括MYB11、MYB111和MYB12三个成员，对拟南芥黄酮醇类物质合成起着重要的调控作用。已有研究表明苦荞含有高活性黄酮醇类物质-芦丁。我们前期研究工作证实苦荞品种间芦丁含量存在差异，且外源生理生化因子影响其芦丁的合成及结构基因表达变化，为进一步揭示苦荞黄酮醇类物质合成的转录调控机制，我们拟从苦荞中克隆调控黄酮醇类物质合成的R2R3-MYB SG7类转录因子，进行功能分析：（1）keypoint技术筛选苦荞myb11、myb111和myb12突变体，比较分析黄酮醇含量变化部位及结构基因表达差异，明确该类转录因子调控的靶基因及调控部位；（2）EMSA技术验证转录因子与靶基因启动子的相互作用；酵母单杂技术验证转录因子的转录激活特征。上述结果将揭示苦荞R2R3-MYB SG7类转录因子参与黄酮醇类物质的转录调控机制，为苦荞分子育种提供科学依据。

苦荞是一种药食兼用的小杂粮作物，富含高活性的黄酮醇化合物芦丁，目前调控拟南芥黄酮醇代谢途径的MYB转录因子已明确为Sg7亚家族。本项目结果总结如下：(1)已克隆鉴定的FtMYB7基因（KM588379），全长cDNA序列876bp，编码291个氨基酸；FtMYB9基因（KM588380），全长cDNA序列912bp，编码303个氨基酸；它们均含有典型的R2R3型MYB结构域。通过构建系统进化树初步确定：FtMYB7与拟南芥Sg1亚家族聚为一类；FtMYB9与拟南芥Sg7亚家族聚为一类。(2)‘九江苦荞’全生育期各组织实时定量表达分析结果表明： FtMYB7基因在S3(真叶期)和S5(现蕾期)基因相对表达量最高，达到501和867倍；FtMYB9基因在S1(萌发期)和S2(子叶期)相对表达量最高，分别为34倍和72倍。相关性分析表明：8个生长时期中，Ft4CL、FtCHS、FtF3H、FtUFGT基因和FtMYB7基因相对表达模式与芦丁含量变化幅度呈正相关，其相关系数分别为0.748、0.683、0.704、0.890和0.862。而FtFLS-like基因和FtMYB9基因与芦丁含量的变化幅度呈负相关，其相关系数分别为-0.442和-0.501。(3)通过对野生型烟草叶片微针注射农杆菌进行瞬时表达、原位黄酮染色，结果表明分别注射35S:FtMYB7和35S:FtMYB9以及共同注射35S:FtMYB7和35S:FtMYB9后，烟草叶片均产生明显荧光现象，表明有大量黄酮类物质合成。(4)烟草转基因实验，共获得FtMYB7转基因烟草株系3个，FtMYB9转基因烟草5个，FtMYB7和FtMYB9杂交后代株系3个，荧光定量表达分析结果表明：FtMYB7和FtMYB9基因对NtCHS基因的表达起负调控作用，FtMYB9基因对NtF3H、NtFLS基因的表达起正调控作用。这些结果为探究苦荞富含高活性芦丁化合物的调控机理提供了理论基础，也为进一步利用基因工程手段提高苦荞籽粒中芦丁含量提供可操作的分子靶位点。