基于M2型巨噬细胞极化探究神经营养因子MANF减轻脑缺血损伤的作用机制

M2 macrophage can alleviate cerebral ischemia injury, therefore it is meaningful to develop the target that modulates M2 macrophage polarization. Our team found that neurotrophic factor MANF affects M2 macrophage polarization, decreases infarct size and lowers mortality rate after stroke. MANF has no effect on DREAM mRNA level, but down-regulates DREAM expression. Based on the previous study, we proposed the hypothesis: MANF induces DREAM degradation, increases A20 expression, suppresses NF-κB p65 translocation, which modulates M2 macrophage polarization and protects ischemia injury. In order to verify this hypothesis, MANF-/- mice, gene silencing, gene over-expression, immunofluorescence, co-immunoprecipitation are applied to prove: ①MANF modulates M2 polarization after cerebral ischemia, ②M2 modulated by MANF protects brain from ischemia injury, ③MANF induces DREAM degradation, up-regulates A20 expression, inhibits NF-κB p65 translocation and modulates M2 macrophage polarization. Our study will provide new sight for ischemic stroke therapy.

M2型巨噬细胞在修复脑缺血损伤过程中扮演重要角色，但调控其极化的机制尚不明确。前期工作初步发现神经营养因子MANF影响M2型巨噬细胞极化，改善脑缺血损伤；进一步研究发现MANF显著下调脑组织M2型巨噬细胞中转录抑制子DREAM蛋白水平并升高A20表达量，但对DREAM mRNA水平无影响。基于前期工作提出科研假说：MANF通过诱导DREAM蛋白降解、上调A20表达、抑制NF-κB p65入核，调控M2型巨噬细胞极化进而减轻脑缺血损伤。为论证该科研假说，本课题拟应用MANF-/-小鼠及基因沉默、免疫共沉淀等技术：①从正反两方面明确MANF调控脑缺血后M2型巨噬细胞极化；②揭示MANF调控的M2型巨噬细胞极化对脑缺血损伤的保护作用；③阐明MANF通过促进DREAM蛋白降解、上调A20表达、抑制NF-κB p65入核，进而调控M2型巨噬细胞极化。本课题可为治疗缺血性脑卒中药物的开发提供新靶点。

在世界范围内，缺血性中风仍然是致残和死亡的主要原因，老年患者的老年相关炎症会导致中风后血脑屏障(BBB)破坏比年轻患者更严重。因此，抑制过度炎症可以减轻血脑屏障损伤，为老年人缺血性脑中风的治疗提供了可能。既往研究发现，中脑星形细胞来源的神经营养因子(MANF)可调节炎症反应，减轻衰老过程中的肝损伤。然而，尚不清楚MANF是否对缺血性中风小鼠的单核巨噬细胞极化以及老年小鼠的血脑屏障有类似的益处。前期实验发现MANF显著性降低脑缺血小鼠死亡率，在阻断外周单核细胞进入脑组织后MANF未降低脑缺血小鼠死亡率，同时发现MANF调节DREAM/A20/NF-κB p65信号通路进而调控M2型巨噬细胞的极化；此外，本课题组对18-20月龄老龄小鼠进行大脑中动脉闭塞(MCAO)致短暂性脑缺血实验。MCAO后2h向右侧脑室注入MANF。MCAO后72h测定血脑屏障完整性、紧密连接蛋白、微血管超微结构、梗死面积、神经学评分、脑水含量、促炎细胞因子、中性粒细胞浸润率。本团队证实了衰老状态下的脑缺血/再灌注促进了脑内皮细胞MANF的过表达。外源性补充MANF可抑制促炎因子的产生，恢复血脑屏障的完整性，进而减轻梗死面积、神经评分、脑水含量和中性粒细胞浸润率。此外，MANF通过TLR4/MyD88/NF-κB通路干预促炎因子的产生，维持老年脑缺血后血脑屏障的完整性。综上所述，MANF在缺血性中风后免疫调节及血脑屏障修复作用可能为缺血性中风的治疗提供新的理论支撑。