最简生物固氮系统的构建及其向真核系统的转移

The engineering of plants (non-leguminous crops) capable of fixing its own nitrogen is one of the ultimate goals for Biological Nitrogen Fixation (BNF) research field. The development of new biological technology, especially the rise of synthetic biology, is bringing new opportunities for the study of BNF. Horizontal transferring of the nitrogen fixation system to the plants’ (crops’) cell always been considered as one of the main approaches to make the plants (crops) fix its own nitrogen. As indicated by previous study, the chloroplast and mitochondrion may provide the most suitable locations for the nitrogen fixation system. In this proposal, we will try to complete the following tasks by using the synthetic approaches: 1) To construct an efficient T7 RNA polymerase-dependent expression system in the chloroplast of algae and in the mitochondrion of yeast. 2) To construct a more simplified and more efficient nitrogenase system by using the “minimal FeFe nitrogenase system” as chassis. 3) To reconstruct a functional nitrogenase system in the engineered-chloroplast or engineered-mitochondrion by direct transferring the most simplified and most efficient nitrogenase system to them. This research project has a great impact for the sustainable development of agriculture in our country.

实现非豆科农作物的自主固氮，从根本上解决化学氮肥带来的对农业发展的负面影响，是生物固氮研究的终极目标之一。随着合成生物学的发展，正在为生物固氮研究带来新的机遇。将生物固氮系统直接导入植物细胞，被认为是实现植物（农作物）自主固氮的重要途径之一。前期研究显示，植物的叶绿体和线粒体是固氮系统导入的理想场所。本项目拟通过合成生物学手段，在叶绿体及线粒体中建立具有广泛适用性的依赖于T7 RNA聚合酶的高效表达系统；同时，以本课题组最新研究成果“最简铁铁固氮系统”为底盘，通过遗传操作改造、优化该系统，使之进一步简化及高效，且与未来宿主达到最佳适配性；最终将简化高效且适配性良好的固氮系统导入真核模式生物（如衣藻及酵母）改造后的叶绿体或线粒体，在叶绿体或线粒体中，通过定量分析，在分子水平搭建最简、高效生物固氮体系，并分析检测其体内、体外生物固氮活性。这一研究对于实现我国农业的可持续发展具有重要的意义。

本项目通过合成生物学手段，在将生物固氮系统直接导入植物细胞的方向上，特别是在提高固氮酶系统与未来宿主之间的适配性方面，取得了一系列突破性的研究成果：1）在大肠杆菌中实现了植物源电子传递链模块的重构及与固氮酶系统的适配性研究（Yang and Xie et al. 2017, PNAS）。该研究成果，一方面解决了固氮酶系统转入植物靶细胞器后，还原力供给的问题；另一方面进一步减少了需要导入植物细胞器的固氮酶系统基因数目（如：铁铁固氮酶系统将最少只需要8个基因）。另外，植物叶绿体中的电子传递链模块为植物光合作用中还原力分配的核心组件，该研究为光合作用和生物固氮相偶联提供了新的思路，以实现植物自主固氮这一终极目标有着极其重要的指导意义；2）成功构建了《超简钼铁固氮酶系统》（Yang and Xie et al., PNAS, 2018）。该研究将18个基因的产酸克雷伯菌钼铁固氮酶系统成功的转化为5个编码Polyprotein的巨型基因，并证明其高活性可支持大肠杆菌以氮气作为唯一氮源生长！这一研究成果，使得新构建的固氮系统更符合未来向真核系统乃至农作物转化的需求，使人类进一步看到了彻底摆脱工业氮肥的曙光；3）成功的构建了《稳定通用高效固氮酶系统》（Xiang et al., PNAS, 2020）。该研究通过揭示固氮酶核心酶组分NifD蛋白在真核细胞器线粒体中异源表达不稳定的机制，同时进一步筛选到了在线粒体具有高稳定性的NifD突变体，从而向构建稳定通用高效的固氮酶系统又迈出了新的一步。此外，我们还构建了一整套具有不同强度的T7 启动子突变体，为本项目的顺利进行提供了保障。总之，通过开展本项目研究，我们大大的增加了固氮酶系统向真核系统转移的可能性，为实现农作物自主固氮的最终目标进一步打下坚实基础。