pH调控组织工程毛细血管管腔直径的机制研究

Capillary lumen diameter is a key factor for proper functioning of tissue-engineered capillaries. However, no previous publication has elucidated mechanisms by which lumen diameter of tissue-engineered capillaries is regulated. Our preliminary data showed that extracellular pH regulated the capillary diameter in 3D collagen gel. Also, pH increased the phosphorylation of Akt independent from growth factor stimulation. In addition, inhibitors of Akt, Plasmin, and MMPs inhibited the pH-induced capillary lumen enlargement in 3D collagen gel. Based on our results, we hypothesized that it is via Akt/Integrin β1/MT1-MMP/uPA/Plasmin pathway that pH regulates capillary diameter in 3D collagen gel. To test our hypothesis, this project will use Western-blot, Realtime PCR, Zymography, TEM and SEM to discover the mechanism by which pH activate Akt pathway, to verify whether pH activate key proteinase via the Akt/Integrin β1/MT1-MMP/uPA/Plasmin pathway，and to clarify the key proteinases which are invovled in the regulation of capillary lumen diameter by pH. This project will reveal the mechanism by which pH regulates tissue-engineered capillary diameter, and shed light on constructing functional tissue-engineered capillaries with controllable lumen diameters.

管腔直径是组织工程毛细血管发挥正常功能的关键因素，然而其调控机理尚不清楚。项目组的前期工作显示：培养液pH通过影响VECs膜周MMPs和Plasmin对三维胶原支架的降解从而调控毛细血管管腔直径；pH通过激活Akt进而调控管腔直径。结合国内外研究进展，项目组假设：pH增高活化定位于VECs膜周的Akt/Integrin β1/MT1-MMP/uPA/Plasmin通路，激活胶原降解酶，导致VECs膜周胶原支架降解和毛细血管管腔的扩大。本项目拟采用细胞和分子生物学、体外酶化学、电镜等方法，研究pH激活Akt的机理，明确pH是否通过Akt/Integrin β1/MT1-MMP/uPA/Plasmin通路以及激活哪几种胶原降解酶从而导致了毛细血管管腔直径的扩大。本项目的实施将揭示pH调控组织工程毛细血管管腔直径的机理，为构建管腔直径可控的功能性组织工程毛细血管打下基础。

管腔直径直接影响毛细血管的生理功能，其调控机制对于构建功能性组织工程毛细血管具有重要指导意义。目前组织工程毛细血管管腔直径的调控机理还不清楚，尚不能构建管腔直径可控的功能性组织工程毛细血管，极大限制了组织工程的进展。项目组研究显示：培养液的pH值对三维胶原内毛细血管的管腔直径具有明确的调控作用；毛细血管管腔形成继发于血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells，VECs）对其细胞膜周围三维胶原支架的降解，且胶原支架降解后形成的空腔直径决定管腔直径；VECs内表达多种参与胶原降解的蛋白酶（如MMP1和2、MT1-MMP、uPA等），且MMPs广谱抑制剂GM6001（可抑制MMP1和2、MT1-MMP）和Plasmin抑制剂（uPA下游活性分子）可以明显抑制pH对毛细血管管腔直径的调控作用。这些结果提示pH通过影响VECs膜周“关键蛋白酶”对胶原支架的降解进而实现毛细血管管腔直径的调控。项目组的进一步研究显示：pH不依赖于生长因子的刺激调控Akt的磷酸化，且Akt抑制剂可明显抑制pH对毛细血管管腔直径的调控作用。这说明pH通过激活Akt通路调控毛细血管管腔直径，且可能与生长因子无关。项目组进而采用MT1-MMP特异性抑制剂和MMP2特异性抑制剂，结果显示可以明显抑制毛细血管的管腔增大。这些结果证明：pH增高激活Akt后，通过定位于VECs膜周的Akt/Integrin 1/MT1-MMP/MMP2通路，导致VECs膜周胶原支架的降解和毛细血管管腔扩大。另外有研究证明pH可以调控肺动脉血管内皮细胞内的活性氧自由基（Reactive Oxygen speicies， ROS）水平，而ROS可以激活Akt，且项目组采用ROS抑制剂可以明显抑制管腔扩大，因而项目组认为pH可能通过ROS激活Akt。本项目的研究初步揭示pH调控组织工程毛细血管管腔直径的机理，可推动管腔直径可控的功能性组织工程毛细血管的构建，并为揭示体内毛细血管管腔直径的调控机理提供新的思路。