茶树芳香物质代谢重要候选基因的关联分析及其功能研究

Tea plant (Camellia sinensis (L.) O.Kurtze) is an important beverage crop. The variety of tea plant is the material basis of sustainable development of tea. The influence of the complexity and environment interaction of tea aromatic material metabolism, especially the insufficient understanding of the heredity of aromatic substances metabolism results in the slow progress of varieties breeding for tea plant with high aroma. The tea plant aromatic substances are complex traits controlled by polygene and each gene may have minor effect on the high aroma, the complicated relationship of which cannot be completely analyzed by the existing research results and classical linkage analysis. The association analysis on the polymorphism of related gene molecule and aromatic character using the TASSEL software is carried out in this paper combined with the determination of phenotypic traits related to aromatic material metabolism, where the natural population materials with quite different genetic background and various aroma discovered in the former researches are utilized, and the EcoTILLING technique is adopted to discover the SNPs of gene closely related to aromatic material metabolism exiting in the material genomic DNA or its insertion and deletion polymorphism. As a result, the SNPs closely related to traits are obtained, and the mechanism of related gene in aromatic material metabolism is elucidated. The functional makers closely related to high aroma and adapted to various genetic backgrounds can be further empoldered to provide important basic theory and technical support for the rapid selection of tea plant with high aroma.

茶树是重要的饮料作物。茶树品种是茶叶可持续发展的物质基础。由于茶树芳香物质代谢的复杂性和环境互作的影响，特别是对芳香物质代谢的遗传认识不足，导致高香型茶树品种选育工作进展缓慢。而且茶树芳香物质是由多基因控制的复杂性状，每一个基因可能对高香型起着微效作用，已有研究结果和经典连锁分析方法难以完全解析这一复杂的关系。本项目利用前期研究发现的遗传背景差异较大且在香型上具有多样性的自然群体材料；采用EcoTILLING技术发现与芳香物质代谢重要候选基因在材料基因组DNA序列中存在的SNPs或插入/缺失等多态性，结合测定这些材料与芳香物质代谢相关的表型性状，运用TASSEL软件对相关基因分子的多态性与芳香性状进行关联分析，获得与性状紧密关联的SNPs，阐明相关基因在芳香物质代谢中的作用机制，继而开发出与高香型密切相关且适用于多种遗传背景的功能标记，为高香型茶树品种的快速选育提供重要基础理论和技术支持。

本研究采用表型测定和PCR技术相结合的方法，通过转录组测序和实时荧光定量PCR发现芳香物质代谢相关基因在所有材料基因组序列中的多态性，获得基因单体型与高香型性状的关联关系，阐明这些基因在芳香物质代谢过程中的作用机制。.1. 采用SSR分子标记对红茶、绿茶、红绿兼制、乌龙茶4个制茶品质不同的78个茶树品种（品系）进行遗传结构分析及关联性分析。21对SSR引物总共扩增77条带，位点数平均为3.667，有效位点数平均为2.234，平均扩增基因型为4.952。亲缘关系分析表明，参试品种根据遗传背景相似程度主要分为3大类群。.2. 采用SRAP标记中的21对引物，41个有代表性的茶树种质扩增，共扩增出81条带，其中多态性带数为77条，平均每对引物组合产生3.7条带，其多态性比率在60％-100％之间，平均为95.32％。铁香茗与金萱相似系数达到0.8。.3. 利用MFLP分子标记技术建立了适合茶树的反应体系，6对MFLP选择性扩增引物共同扩增出288条带，其中多态性条带232条，多态性为80.6%，表明同一地理位置、不同有性繁殖群体的基因组存在差异性。.4. 实时荧光定量PCR试验表明，六个品种的β-葡萄糖苷酶基因表达量高于湘妃翠。GC-MS联用仪测定铁香β-葡萄糖苷类香气物质苯甲醇含量远远高于其它品种，10g茶粉中β-葡萄糖苷类香气物质苯甲醇含量达到16.279μL。.5. 通过Illumina高通量测序技术，得到薮北注释到GO数据库的Unigene为24047，注释到KOG数据库的为12249，注释到KEGG数据库的为11297。湘妃翠注释到GO数据库的Unigene为23899，注释到KOG数据库的为11912，注释到KEGG数据库的为10663。铁香茗注释到GO数据库的Unigene为21941，注释到KOG数据库的为10725，注释到KEGG数据库的为9875。通过NR注释，发现5条可能编码β-葡萄糖苷酶基因，根据各基因的FPKM值得出β-葡萄糖苷酶在铁香茗中优势表达，在薮北中表达最少。.6. 采用Illumina HiSeq测序，茶树出现斑锦变异叶片的白化部分与同一株正常表现型叶片的相同部位差异基因表达显著上调或下调。