基于AMPK信号通路研究菝葜黄酮调控脂类代谢分子机制

AMP activated protein kinase (AMPK) is the key targets of energy metabolism in vivo. The previous researches of Smilax china L. (SCL) powder and SCL extract had preventive obesity effect, but which components of SCL and mechanism of anti-obesity effect is unclear. The project will further separate SCL flavonoids, investigate the mechanism of anti-obesity effect in SCL flavonoids. First, SCL flavonoids add to the high-fat diet-fed mice, measure body weight and intraperitoneal adipose tissue, serum biochemical indexes and liver lipids in mice. Make biopsies of liver and adipose tissue, HE staining and observation. Analyze activities, genes and protein expressions of lipids metabolism-related factors via AMPK signal pathway by technology of ELISA, RT-qPCR, western blot. Second, using of 3T3-L1 cells model, measure cells proliferation, cell differentiation and fat accumulation by SCL flavonoids. Analyze gene and protein expression levels of nuclear transcription factors and lipids metabolism-related enzymes. To reveal the relationship between anti-obesity and SCL flavonoids from cell level mediated by AMPK signal pathway, clarify to regulate the key targets. The project will establish a theoretical principle for research and develop a new anti-obesity functional factor, and provides a scientific basis for the further utilization and development for SCL.

AMP激活蛋白激酶(AMPK)是调节体内能量代谢的关键靶点。项目组前期研究发现菝葜、菝葜提取物有预防肥胖作用，但是菝葜提取物中何种成分起作用及其作用机制还不清楚。本项目通过分离菝葜黄酮，研究菝葜黄酮降脂减肥作用机制。首先，菝葜黄酮添加到高脂饲料喂养小鼠，测定小鼠体重和腹腔内脂肪质量，血液和肝脏生化指标；对肝脏和脂肪组织切片进行HE染色，观察脏器组织变化；用ELISA、RT-qPCR、蛋白印迹等技术分析AMPK通路脂类代谢相关因子的活性、基因和蛋白表达量。其次利用3T3-L1细胞模型，分析菝葜黄酮干预后脂肪细胞增殖，细胞分化以及脂肪沉积量，核转录因子和脂肪代谢相关酶的基因和蛋白表达水平，从分子水平揭示菝葜黄酮通过AMPK信号通路与降脂减肥的关系，阐明菝葜黄酮调控脂类代谢作用的关键靶点和分子机理。本项目将为研发新降脂减肥功能因子奠定理论基础，为菝葜开发和利用提供科学依据。

菝葜（Smilax china L.）是我国一种著名的中药材，菝葜黄酮（SCP）作为菝葜药理作用主要的成分之一具有很高的研究价值，但关于其成分和能量代谢的研究报道较少。本项目通过菝葜根茎经提取纯化后得到SCP，鉴定SCP的成分。研究SCP对小鼠和3T3-L1细胞的脂类代谢的影响。主要研究成果如下：.1、SCP纯度为91.38%，鉴定出18种酚类化合物。.2、将50只雌性ICR小鼠随机分为5组，分别为对照组、高脂组以及SCP低、中、高剂量组。试验期间，SCP剂量组小鼠分别100、200、400 mg/kg·bw·d的SCP持续灌胃12周。结果显示，SCP有效降低体重增加、肝脏指数、腹膜内脂肪指数、血清脂质、炎症因子、葡萄糖和胰岛素浓度，且胰岛素抵抗指数也明显减小。SCP显著降低了肝脏的TC和TG含量。此外，SCP显著上调AMPK、UCP-1、GLUT4、IRS1、IRS2、AKT、ACO和PKA的基因和蛋白表达，同时明显下调mTORC1、SREBP1c、FAS、HMGCR、FOXO1、p-IKBα和P65的基因和蛋白表达。.3、用3T3-L1脂肪细胞实验模型进行实验结果显示，SCP显著降低3T3-L1细胞的细胞内脂质沉积。SCP明显增加3T3-L1细胞的脂质分解相关基因和蛋白（PKA、HSL、ATGL、PKA、pHSL/HSL）的表达，并上调脂肪酸β氧化相关基因CPT、ACO、PPARα的表达水平。SCP给药增加脂肪细胞米色化相关基因Tmem26、Tbx1、CD137和Cidea1的表达，和显著增强棕色化相关基因和蛋白UCP-1、PGC-1α、PRDM16、PPARγ和Sirt1的表达。通过拮抗剂和激活剂的实验进行分析，SCP可能通过β3-AR/AMPK信号通路刺激3T3-L1脂肪细胞褐变，促进产热，减少脂肪沉积。.以上结果显示，SCP有效降低高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗和脂肪沉积，可能在小鼠肝脏通过IRS/AMPK信号通路改善体内胰岛素抵抗及调节脂质相关基因和蛋白的表达。另外，SCP通过激活β3-AR/AMPK信号通路，增加脂肪细胞中脂解和脂肪酸β氧化；增加线粒体生物发生相关基因及棕色化细胞特异性相关蛋白的表达来促进褐变，增加产热，进而减少脂肪细胞的脂肪沉积。因此，SCP可能在未来作为一种天然的减肥的药物。