大黄改善人源化AD模型大鼠认知障碍的药效物质及多途径作用机制研究

To solve the scientific problems of multi components and multi pathways of traditional Chinese Medicine, this project choses rhubarb which has direct action of active components and the regulation of intestinal flora, as research carrier, exploring effective substance of the rhubarb improving Alzheimer's disease (AD) cognitive impairment and the mechanism of its multi pathways. Based on the accomplishment of chemical composition, metabolism and distribution, metabolomics and drug efficacy in the early stage finding the multi pathways of rhubarb improving AD cognitive impairment, this project intends to establish the AD model in humanized rat, combine of metabolomics and proteomics analysis, establish drug chemical group analysis- intestinal flora- potential drug substances and their distribution in vivo- drug targets / acting medium- drug derived active components in vivo- retrospective and validation of the prototype of the traditional Chinese Medicine-multi pathway interpretation, providing a reference model for study on the basis of TCM. Based on the dual approach between pathological process and the target of the direct effect of free anthraquinones on AD and rhubarb glycosides regulate of intestinal flora and intestinal wall related receptors, generating endogenous active substances, improving the AD pathological, this project systematic interpretates of rhubarb improving source pharmacodynamic action and mechanism of cognitive impairment in humanized rats, which provides scientific basis for clinical treatment of rhubarb, meanwhile it has an important academic value and scientific significance to provide a new idea for the study of the effective substance and mechanism of TCM.

针对中药多成分、多途径作用的科学问题，本课题选择既具有药效成分直接作用、又具有肠道菌丛调节作用的大黄为研究载体，探索其改善阿尔兹海默病（AD）认知障碍的药效物质及其多途径作用机制。在前期化学成分、代谢与分布、代谢组学、药效等研究发现大黄改善AD认知障碍存在着多途径作用的基础上，采用人源化大鼠AD模型，结合代谢组、蛋白组分析，构建“化学物质组-作用靶点/效应介质-体内潜在药效物质、验证-中药原型药效成分回溯、验证及多途径作用阐释”为主线的中药药效物质研究模式，从“大黄游离蒽醌类成分直接作用于AD的病理环节及其靶点” 和“苷类成分调控肠道菌丛和肠壁相关受体，改变了内源性活性物质表达量，调控机体炎症反应，改善AD病理环节”双重途径，系统阐释大黄改善人源化大鼠认知障碍的药效物质及其作用机制，为大黄临床治疗AD提供科学依据，并为中药药效物质及其作用机制研究提供新思路，具有重要的学术价值和科学意义。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）属中医“痴呆”、“呆病”、“健忘”、“善忘”等病名范畴，且“毒损脑络”是其重要病机。大黄是基于中医“毒损脑络”理论治疗AD的临床最常用中药之一，通过“降浊益智、以泻为补”发挥治疗AD的作用，但其具体作用机制尚不清楚。本项目从药效成分直接作用和肠道菌丛调节作用两条途径探索大黄AD认知障碍的药效物质及其作用机制，具体研究结果如下：.（1）大黄酸作为大黄中的主要抗炎活性成分，显著改善了APP/PS1小鼠的认知行为，下调了小鼠海马区淀粉样斑块沉积和活化小胶质细胞数量，降低了海马组织中可溶性总Aβ、Aβ1-42以及炎症因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达；大黄酸降低了APP/PS1小鼠海马组织中NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、IL-1β和Caspase-1的表达；联合代谢流技术及生化分析发现并验证了谷氨酰胺回补通路是调控NLRP3炎症小体活性的关键通路；大黄酸抑制小胶质细胞内的谷氨酰胺回补通路代谢，降低了NLRP3炎症小体活性，从而抑制AD神经炎症并最终改善AD认知功能障碍。.（2）肠道菌-脑途径，采用肠道微生物组学和粪便代谢组学研究方法，对大黄通过作用于肠道菌群途径改善AD认知功能障碍的机制进行研究。首先对实验过程中灌胃小鼠的大黄水煎液化学成分的一致性进行评价和质控；从行为学、组织病理学和生化指标3个方面证明大黄具有改善APP/PS1双转基因小鼠认知功能障碍的作用；采用16S rRNA基因测序技术揭示了APP/PS1双转基因小鼠粪便样本肠道微生物结构，明确了与AD病理机制相关的关键肠道菌属；揭示了大黄干预AD模型小鼠粪便代谢组的扰动情况；采用荧光定量PCR，对大黄发挥治疗AD药效所调节的肠道菌属进行验证，采用关键菌属-粪便代谢组差异代谢物-炎症因子和生理生化指标之间的共网络分析，明确大黄作用的关键菌属和关键差异代谢物，发现邻酪氨酸是大黄通过肠道菌途径发挥治疗AD作用的关键生物标志物，完成机制阐释。.该项目对两条作用途径进行详细、具体的研究，为中药治疗脑病的机制研究提供了示范，为大黄治疗AD药物的研发提供了坚实的数据支撑。