MicroRNA-296-5p通过CDX1调控胃粘膜上皮肠化生的机制研究

Gastric intestinal metaplasia (IM) is the most important precancerous lesion of gastric carcinoma.It is reported that activation of CDX1,which is specifically expressed in intestinal epethelial cells, may be a key factor during the development of gastric intestinal metaplasia, but the mechanism remains to be fully elucidated. Our previous work confirmed CDX1 expression is upregulated in IM tissues. We also found that miR-296-5p inhibits SOX2 expression by directly binding to its 3’-UTR.However,the regulation of miR-296-5p/CDX1 pathway in the development of IM have not been elucidated. This project is going to explore the correlation of miR-296-5p and CDX1 expressions in IM cell model induced by bile acids using PCR and western blot;To investigate the functions of miR-296-5p and CDX1 in gastric IM in gain-of-function and loss-of-function model using lentiviral vector and siRNA;To explore the mechanism of CDX1 and its downstream genes through Ch-IP,EMSA, and luciferase reporter gene assay;To verify the relationship among miR-296-5p, CDX1,and its downstream genes in clinical IM tissues using in situ hybridization and immunohistochemisty.This project aims at elucidating the function and mechanism of miR-296-5p/CDX1 pathway in gastric IM, further understanding intestinal metaplasia on microRNA and transcriptional factor level, and offering theoretical and experimental proof for the diagnosis and treatment of gastric precancerous lesion.

胃粘膜肠化生是胃癌最重要的癌前病变，其发生机制尚不清楚。CDX1表达异常增高被认为与肠化生密切相关。我们前期研究发现肠上皮化生的组织中CDX1表达明显升高，并证明miR-296-5p在胃癌中通过靶向CDX1调控其表达。而肠化生的过程中miR-296-5p/CDX1通路发挥的调控作用尚无报道。本项目拟通过免疫印迹、PCR等方法在肠化生细胞模型中验证miR-296-5p和CDX1的表型；通过慢病毒载体、siRNA技术和扫描电镜等技术研究miR-296-5p调控肠化生的功能及CDX1对其功能的介导作用；利用免疫共沉淀、截断报告基因实验和免疫印迹等实验明确CDX1下游相关基因；并最终在临床肠化生组织标本中验证miR-296-5p和CDX1及其下游基因的相关关系。本项目旨在探索胃癌重要癌前病变-肠上皮化生过程中的分子调控机制，以期初步阐明miR-296-5p/CDX1通路在胃粘膜上皮肠化生中的作用。

研究背景：胃癌是我国发病率最高的消化系统恶性肿瘤，研究癌前病变的发生及转归机制至关重要。胃粘膜的肠上皮化生是胃癌最常见的癌前病变，发生肠化生后癌变几率明显增高，但其发生机制不清，因此阐释肠上皮化生及时采取干预措施，将胃癌的恶性表型遏制在癌前阶段，是降低肿瘤发生率和致死率最重要的途径。.研究内容及结果：①验证了包括miR-296在内的多个miRNA与CDX1及其他靶分子在肠化生组织和细胞中的表型。课题组在前期实验结果基础上,建立了胆汁酸诱导胃细胞发生肠化生的细胞模型,通过microRNA微芯片检测和筛选，发现胆汁酸能够诱导miR-296-3p和miR-296-5p的表达升高。并进一步验证了相关分子在肠化生组织中的表型。.② 研究了包括miR-296在内的多个miRNA对调控肠化生的功能。构建miR-296-3p/5p的功能获得/缺失细胞模型，进而验证CDX1和其他靶分子及其下游的肠标志物分子的表达，从而在体外验证miR-296-5p调控肠化生的功能；收集临床肠化生标本在体内验证相关miRNA及其靶基因调控肠化生的功能。. ③探索了靶基因介导包括miR-296在内的多个miRNA对肠化生的调控功能。明确胃细胞肠化生中miR-296-5p/CDX1通路存在的基础上，进一步研究CDX1及其他分子下游调控机制。.④验证了临床标本中miRNA及其靶分子的表达。收集临床标本收集，签署知情同意书。胃镜下选取正常胃组织及肠化生组织。，提取组织RNA及蛋白质，分别通过Real-time PCR、western blot和免疫荧光技术，检测标本上述分子表达变化。. 研究意义：本项目聚焦胃癌最重要的癌前病变—胃粘膜肠上皮化生，探索了胃细胞肠化生发生的分子机制，通过基因芯片技术和生物信息学分析手段建立了肠化生调控的miRNA-靶分子调控网络，筛选了关键的miRNA分子及关键靶分子，并通过多种方法探寻包括CDX1在内的多个靶分子在肠化生病理变化中受多个miRNA靶向调控的分子机理，深入研究CDX1等靶分子转录调控下游基因的内在机制。本项目本项目旨在探讨肠上皮化生发生的原因与机制，重点研究miRNA-靶基因调控网络导致胃上皮细胞肠化生的分子机制，为胃癌癌前病变的早期干预和胃癌防治提供了新的思路。