RNA上5-甲基胞嘧啶修饰对miRNA加工过程的调控机制研究

RNA methylation are important epigenetic markers, they affect biological development and disease by regulating RNA metabolism. Among RNA methylation, m5C modification is poorly understood. Our previous studies suggested TET2, a member of Ten-eleven translocation(TET) protein family, can bind microRNA(miRNA) in mouse embryonic stem cells(mESCs). We propose TET2 can regulate m5C level in miRNA as a m5C oxidase. To investigate the distribution of m5C and hm5C on miRNA, we intend to do MeRIP combined with next generation sequencing. To study whether TET2 can affect miRNA processing by removing m5C modification, we plan to apply sRNA-seq and RIP technic. We also plan to use biochemical method to explore how TET2 recognize miRNA. Based on this project, we hope to better understand function and dynamic regulation of m5C RNA methylation, illuminate new function of TET2 and new miRNA processing pathway.

核糖核酸(RNA)甲基化对RNA代谢起关键的调节作用。RNA甲基化修饰中胞嘧啶第五位甲基修饰(m5C)的研究还停留在起步阶段。经过前期研究，我们发现在小鼠胚胎干细胞中Ten-eleven translocation(TET)家族成员TET2能结合microRNA(miRNA)转录本，TET2可能作为m5C氧化酶参与了对miRNA上RNA甲基化修饰的调控。本研究拟用小鼠胚胎干细胞为模型，利用甲基化核糖核酸免疫沉淀技术(MeRIP)揭示miRNA上m5C和hm5C的分布。运用小RNA测序(sRNA-seq)和核糖核酸免疫沉淀技术(RIP)研究TET2作为miRNA上m5C修饰氧化酶影响miRNA加工的机制。采用体外生化实验进一步确定TET2与miRNA相互作用的生化基础。本项目旨在丰富人们对RNA甲基化修饰的认识，探索TET2参与细胞内表观调节的新机制，阐明miRNA信号通路新的调控机制。

RNA胞嘧啶第五位甲基修饰(m5C)与环境响应密切相关，然而其调控机制的研究还停留在起步阶段，特别是这一修饰如何被擦除并不清楚。本项目在前期发现TET2蛋白结合RNA的基础上，通过引入His标签，建立了新型蛋白-RNA检测技术。运用该技术，结合高通量测序，鉴定了与TET2蛋白互作的RNA，结果表明结合在TET2蛋白上的主要是tRNA。通过体内和体外的酶活检测，本项目证实了TET2蛋白能结合在tRNA上，将甲基氧化成羟甲基，发挥RNA去甲基化的功能。通过CRISPR/Cas9技术，我们构建了TET2缺失小鼠胚胎干细胞。利用TET2缺失细胞为材料，通过小RNA测序，我们发现在TET2缺失的细胞中，tRNA片段(tRFs)的产生异常，并且5’tRFs和3’tRFs的变化方向相反。本项目通过对TET2的研究，发现了这一蛋白在DNA甲基氧化酶之外的功能，揭示了其与tRNA相互作用，催化tRNA上的去甲基化，并最终调控tRFs的产生。本研究阐明了TET2的新功能，发现了RNA修饰对tRFs产生的调控，为深入理解TET2蛋白和tRFs提供了重要的参考。