大肠杆菌人工合成功能寡糖2-岩藻化乳糖的系统研究

This work will aim to construct the synthetic pathway of important functional oligosaccharide 2'-fucosyllactose in Escherichia coli and optimize the relevant gene circuits which can influence the synthetic efficiency by a systematic level. The whole basic research will be performed from three aspects. First, the synthetic module and product transport system for 2'-fucosyllactose will be designed and constructed based on the pathway reactions. The entire pathway was optimized by changing various copies of plasmids and ribosomal binding sites, together with constructing the precursor dynamic pathway regulatory system using stress-response promoters. Next, by constructing the dynamic metabolic regulated network of 2'-fucosyllactose strain, the key nodes, rate limiting steps and key pathways will be identified and bottleneck and target genes will also be defined. Finally, the target genes will be modified to enhance the precursors and cofactors availability, relieve the inhibition of the intermediate accumulation and product transport. Through the above efforts, the high-efficient artificial 2'-fucosyllactose synthetic strain will be obtained and the key metabolic regulatory mechanisms can be elucidated, which lay the foundation for whole cell synthesis of the important functional oligosaccharides.

本研究以大肠杆菌为模式材料，构建重要功能寡糖2-岩藻化乳糖合成途径并对影响生物合成效率的元件进行系统优化，主要从三个方面进行基础研究。构建2-岩藻化乳糖的合成模块并改造产物转运系统，对影响2-岩藻化乳糖生物合成效率的途径基因替换优化质粒拷贝数、核糖体结合位点等，构建2-岩藻化乳糖合成的前体动态感应调控模块，优化各个模块的生物合成，提高人工合成菌株的生产效率；建立2-岩藻化乳糖合成菌株的动态代谢调控网络，以产物为目标模拟识别网络中影响菌株生物合成的关键节点、限速步骤和关键途径，系统分析识别目标化合物在人工合成体系中的瓶颈，确定目标基因；改造目标基因，提高特定功能模块在底盘细胞中的前体供应、辅因子补给，解除中间产物抑制、产物转运限制，打破菌株代谢的局限，最终提高2-岩藻化乳糖人工合成菌株的生产效率并解析关键代谢调控机制，为重要功能寡糖的生物合成研究奠定基础。

母乳寡糖是天然存在于人类母乳中的仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分，对婴幼儿的健康成长具有重要的作用。岩藻化乳糖作为一种重要组成成分，在营养和医药行业具有广阔的应用前景。岩藻化乳糖合成可以通过化学法、酶法实现。化学法由于合成步骤繁琐、选择性差、收率低、副产物多、污染严重，因此工业应用上受到限制。酶法可以在岩藻糖转移酶的作用下将底物乳糖岩藻化，但是反应需要GDP-岩藻糖作为糖供体，价格昂贵。本研究首次基于合成生物学方法构建了岩藻乳糖的合成途径，基于模块分解思路，将涉及产物合成的途径分成五个部分加以优化，包括宿主优化、糖基转移酶筛选、受体糖水平强化、供体糖水平改进以及胞内辅因子NADPH调控，最终解除中间产物限制、前体限速步骤抑制，打破菌株代谢的局限，实现目的产物2'-岩藻乳糖和3-岩藻乳糖的产量最大化合成并解析了关键代谢调控机制，这项工作建立了一个灵活的、可即插即用的功能寡糖模块化途径合成平台，该平台可以为其他寡糖的合成提供重要基础。