亮氨酸缓解早期断奶羔羊肠道氧化损伤的分子机制研究

Leucine, one of the branched-chain amino acids, has antioxidant activity and can relieve the oxidative damage in intestine. This project aims to study the protective effect and mechanism of leucine on the oxidative damage in intestinal tract of early weaned lambs. The cell culture system of lamb intestinal epithelia (LIEC) will be established to determine the antioxidant and protective effects of leucine on oxidative damage induced by LPS. Furthermore, the effects of leucine on Keap1-Nrf2-ARE signal pathway activation and expression of key antioxidant and Phase II detoxifying enzymes will be investigated by using real-time PCR, western-blotting, and immunohistochemistry methods. In addition, the association of Keap1-Nrf2-ARE signal pathway activation with the antioxidant function of leucine in LIEC will be determined by using the RNA interference technology. Whether transcription factor Nrf2 can transmit to the nucleus by the regulation of leucine, activate the Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway and then enhance cellular antioxidant function will be discussed. The output of this project will contribute to clarify for the mechanism of the antioxidant effect of leucine, and provide a theoretical basis for the application of functional amino acids in early weaned lambs.

亮氨酸作为一种支链氨基酸，具有抗氧化的功能，可以缓解肠道的氧化损伤，但其抗氧化作用机理尚不明确。本项目以湖羊羔羊为研究对象，对其饲喂开食料的同时灌喂亮氨酸，研究亮氨酸对早期断奶羔羊小肠抗氧化调节及保护作用；构建羔羊小肠上皮细胞体系，分析亮氨酸对羔羊小肠上皮细胞抗氧化调节效应和内毒素诱导氧化损伤的保护作用；采用实时荧光定量PCR、Western-blotting、免疫细胞化学法等方法研究亮氨酸对Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活的影响；结合RNA干扰技术，解析亮氨酸抗氧化调节Keap1-Nrf2-ARE通路关键信号分子；旨在探究转录因子Nrf2是否能在亮氨酸的调节下进入细胞核，启动Keap1-Nrf2-ARE信号通路，增强细胞的抗氧化功能，从而为探讨亮氨酸在抵抗羔羊早期断奶应激诱导肠道氧化损伤作用机理的揭示提供新思路。

亮氨酸作为一种支链氨基酸，具有抗氧化的功能，可以缓解肠道的氧化损伤，但其抗氧化作用机理尚不明确。本项目在前期动物试验的基础上，进一步将十二指肠、空肠、回肠绒毛长度和隐窝深度进行量化统计发现：添加亮氨酸可以显著增加早期断奶羔羊十二指肠、空肠和回肠的绒毛长度，降低空肠的隐窝深度，对十二指肠和回肠的隐窝深度无显著影响，表明亮氨酸作为功能性氨基酸在缓解小肠氧化损伤上有着积极作用。通过测定空肠上皮抗氧化酶基因及Nrf-2信号通路相关基因表达发现：添加亮氨酸促进空肠上皮超氧化物歧化酶基因的表达，显著增加空肠上皮Nrf-2基因的相对表达量，但HO-1基因的相对表达量显著降低，说明亮氨酸可能是通过激活抗氧化信号通路关键因子发挥其抗氧化功能，从而缓解早期断奶羔羊的小肠氧化损伤。.为进一步明确亮氨酸作用的分子机制，利用奶牛小肠上皮细胞成功构建体外氧化应激模型。综合细胞存活率以及培养液中乳酸脱氢酶释放量确定合适的亮氨酸作用浓度为1.8mmol/L。采用实时荧光定量PCR、Western-blotting、免疫细胞化学法等方法研究发现添加亮氨酸可以增加氧化应激状态下细胞的抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和乳酸脱氢酶）的酶活及其基因与蛋白的表达，降低活性氧浓度和细胞的凋亡，说明亮氨酸对H2O2诱导的奶牛小肠上皮细胞氧化损伤具有保护效果。选择Nrf2-Keap1-ARE信号通路上重要靶点（Nrf2、HO-1和Keap1），分别检测基因和蛋白的表达情况，结果显示添加亮氨酸可以显著增加Nrf2和HO-1的mRNA表达量和蛋白表达水平；细胞核内Nrf2蛋白水平显著增加，细胞质内Nrf2蛋白水平显著下调。通过干扰技术干扰Nrf2表达后，添加亮氨酸对活性氧、细胞凋亡、SOD2和Nrf2的蛋白和基因表达水平均无显著影响，由此可见亮氨酸是通过上调核内Nrf2的蛋白表达，激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路，从而缓解氧化应激。.综上，亮氨酸可以通过上调核内Nrf2的表达水平，激活Nrf2信号通路，促进抗氧化酶类（SOD2，CAT，GPx1）和II相解毒酶类（HO-1）基因的相对表达，从而增强细胞的抗氧化能力最终缓解机体的氧化损伤。