构建新型反式剪接型核酶介导的双报告基因显像体系监测和评估肿瘤RNAi治疗的实验研究

目前肿瘤基因治疗已显示出了良好的应用前景，其中针对血管内皮细胞生长因子（VEGF）的RNA干扰（RNAi）作为一种高效的序列特异性基因沉默技术近年来发展极为迅速。但针对RNAi靶向基因治疗中基因表达过程和治疗疗效的评估尚缺乏在整体条件下动态实时的有效监测手段，目前的荧光显像方法不适用于大动物和人体研究，而核素报告基因显像的灵敏度常不够理想。本项目拟构建以反式剪接型I型内含子核酶为载体核心介导的荧光-核素（EGFP-HSV1-tk）双报告基因新型显像系统，利用核酶自身的特异性IGS引导作用，可明显提高报告基因与靶基因的结合率，大大提高显像的灵敏度和特异性，克服传统方法的不足。实现在整体水平实时、直接地监测肿瘤RNAi基因治疗中siRNA在体内的表达过程、表达持续时间和疗效评价等情况。本研究如获成功，将可建立一种灵敏度高特异性强的新型报告基因显像体系，具有广阔的应用前景。

1.四膜虫提取核酶基因组，PCR获得核酶Rib序列、携带IGS及双报告基因Fluc/tk的核酶Rib53-Fluc-tk质粒：核酶基因组PCR获得Rib DNA，大小为516bp，产物大小与预期一致。2.双荧光素酶报告基因检测剪切产物的荧光素酶活性：逆转录PCR检测MCF-7，SK-OV-3及Hela细胞系中CEA的表达情况；MCF-7细胞系中可见大小约2000bp的条带，测序鉴定为CEA序列；而SK-OV-3及Hela细胞未见明显条带。3. 131I-FIAU放化纯，产率及血浆稳定性：标记率为77.30±3.78%，放化纯为95.96±1.07%，标记产物在人血清24h稳定性为95.74±0.86%。4.131I-FIAU的细胞摄取：在293T细胞中共转染Rib53-Fluc-tk质粒，随着时间的增加，293T细胞对131I-FIAU的摄取逐渐增加，至4.5h是摄取率达到1.40±0.06%，P〈0.01；但在MCF-7及LOVO细胞中，转染Rib53-Fluc-tk质粒后摄取并未显著增加。5.慢病毒的构建及检测：将Rib53-Fluc-tk序列克隆至GV206载体，构建重组慢病毒；病毒滴度为2×108TU/ml。6.细胞生物发光检测： CCD的温度为-90℃，显像时间为2s。可见：较强荧光信号。7.细胞免疫荧光：用鼠抗HSV-tk做细胞免疫荧光，结果显示，慢病毒GV206-Rib53-Fluc-tk感染MCF-7细胞5天后可见细胞胞浆内均匀荧光；未感染病毒的MCF-7细胞荧光图作为control参照；加入CEA的siRNA后，可见胞浆内荧光表达减少。8.乳腺癌裸鼠生物发光显像：取5只荷瘤裸鼠（右下肢注射慢病毒感染的MCF-7细胞），分别于腹腔注射100μl 15mg/ml的荧光素酶底物荧光素-D(D-Luciferin, Xenogen, USA).10min后置于多光谱活体成像系统（CRi，MaestroTM）。CCD的温度为-90℃，显像时间为100s。在右下肢肿瘤部位未见明显生物发光信号。.结论：通过核酶的反式剪切作用，可以选择性地剪切肿瘤靶向分子，从而可以形成由核酶介导的肿瘤靶向分子与报告基因的融合基因表达。