PINK/parkin介导NASH肝细胞线粒体选择性自噬机制及脂肝方的干预效应

Nonalcoholic fatty liver disease hepatitis (NASH) is the key pathological link of simple fatty liver disease progression. NASH liver cell mitochondria serious damages by oxidative stress, but after injury how fragmented mitochondria degradation mechanism is unknown, according to new research, selective autophagy pathway degradation of damaged mitochondria is the key to the liver cell survival mechanism. Previous clinical and experimental proof have shown that "zhiganfang" have antioxidant, protecting mitochondria stress effects. Our hypothesis is that "zhiganfang" may adjust the PINK1/parkin mediated selective autophagy and liver cell mitochondria have been protected in the process of NASH. This project by copying the NASH rats model, differential centrifugation extracting mitochondria, and segregate Cytoplasmic protein, laser confocal microscope observing mitochondria protein localization, electron microscope observing mitochondria autophagy, immunohistochemistry, Western Blot, TR-PCR detecting PINK1/parkin signaling pathway and its downstream mitochondrial autophagy specificity protein Drp1, Fis1, Mfn1, Mfn2, Opa1, P62, LC3, immune coprecipitation detecting protein interactions, we discuss NASH hepatocyte mitochondria selective autophagy and the mechanism of the intervention effect by "zhiganfang", in order to provide objective of basis for "zhiganfang" to prevent and treat NASH.

非酒精性脂肪肝性肝炎(NASH)是单纯性脂肪肝病情进展的关键病理环节。线粒体在氧化应激下大量损伤，但损伤后的线粒体碎片如何被降解的机制不明，最新研究表明，线粒体选择性自噬途径降解受损线粒体是肝细胞存活的关键机制。前期临床和实验证实了脂肝方具有抗氧化应激、保护线粒体的作用。我们假说脂肝方可能通过调节PINK1/parkin介导肝细胞线粒体选择性自噬而起到阻断NASH进程。本项目通过复制NASH大鼠模型，差速离心法提取线粒体，并分离胞浆蛋白，激光共聚焦显微镜观察线粒体蛋白定位，电镜观察线粒体自噬体，免疫组化、Western Blot，TR-PCR检测PINK1/parkin信号通路及其下游线粒体自噬特异性蛋白Drp1，Fis1，Mfn1、Mfn2、Opa1，P62，LC3，免疫共沉淀检测蛋白相互作用，探讨NASH肝细胞线粒体选择性自噬的机制及脂肝方的干预效应，为脂肝方防治NASH提供客观依据。

本项目各个研究计划均已按期顺利完成，取得了一定的成果。.在理论上取得的成果有：阐析了NAFLD进展为NASH的病机演变规律；细胞自噬的发生与中医的气虚、痰瘀关系密切；综述了NAFLD\NASH动物模型的最新进展。.在实验研究上取得的成果有：(1)结果表明脂肝方能够改善肝脏血脂水平以及肝功能水平；脂肝方能够改善血清LDL、HDL及线粒体ROS水平；脂肝方具有增强线粒体活性及降低ROS水平；（2）各组大鼠肝细胞HE染色比较，都具有各种特征性形态；（3）脂肝方具有调节线粒体自噬相关蛋白的表达；（4）各组大鼠肝细胞透射电镜结果比较，都具有各种特征性形态；（5）脂肝方具有调节线粒体自噬相关蛋白的表达；（6）脂肝方具有调节线粒体自噬相关基因的表达；（7）PINK1和Parkin的免疫共沉淀结果发现不同处理组均能检测到不同程度的共沉淀现象，PINK1和Parkin蛋白产生相互作用；其中空白组、模型组和自愈组相互作用程度比较弱，而脂肝方组和西药组作用比较强。LC3和P62的免疫共沉淀结果，发现不同处理组均能检测到不同程度的共沉淀现象，LC3和P62蛋白产生相互作用；自愈组相互作用最弱，空白组和模型组相对也比较弱，而脂肝方组和西药组相互作用比较强。（8）各种免疫荧光结果：LC3蛋白在肝脏中的阳性表达分别位于细胞浆或胞膜，主要集中在中央静脉和汇管区周围；Opa1蛋白在肝脏中的阳性表达分别位于细胞浆或胞膜，主要集中在中央静脉和汇管区周围；P62蛋白在肝脏中的阳性表达分别位于细胞浆或细胞核，主要集中在中央静脉和汇管区周围；Parkin蛋白在肝脏中的阳性表达分别位于细胞浆、细胞核或细胞膜，主要集中在中央静脉和汇管区周围；PINK蛋白在肝脏中的阳性表达分别位于细胞浆，主要集中在中央静脉和汇管区周围；（9）发表学术论文13篇，其中核心期刊6篇。