肉鸡骨骼磷代谢利用规律及其分子机制研究

In the present project, series of experiments in vivo with naturally feeding broilers and in vitro with primarily cultured tibial osteoblasts in combination with the gene silence technique, will be conducted to investigate metabolic utilizations of phosphorus (P) (tibial P retention, P utilization index in osteoblasts, etc.) in the tibia of broilers and primarily cultured tibial osteoblasts and gene-silenced primarily cultured tibial osteoblasts of the key factors (proteins) involved in P metabolic utilizations. Meanwhile, the effect of P levels on mRNA and protein expression levels of the key local regulation factors (matrix extracellular phosphoglycoprotein, fibroblast growth factor 23, etc.), key kinases (proteins) (p38 mitogenactivated protein kinase (p38MAPK), c-Jun N-terminal kinase, extracellular regulated protein kinase, bone morphogenetic protein (BMP), etc.) in BMP/MAPK signal pathway and the gene-silenced key factors (proteins) as well as phosphorylation levels of the above kinase proteins in the tibia of broilers and the above-mentioned primarily cultured cells will be studied. The objectives of the present project will be to systematically and deeply elucidate metabolic utilizations of P in the bone of broilers and its molecular mechanisms. The outcomes from this project will be of great theoretical and practical significances for how to improve dietary P utilization efficiency, save P resources, cut the feed cost and minimize the environmental pollution of P excreted by broilers in the broiler production.

本项目拟通过系列肉仔鸡自然饲喂体内试验和体外原代培养肉仔鸡胫骨成骨细胞并结合基因沉默技术试验，研究肉仔鸡胫骨、原代培养胫骨成骨细胞和磷代谢利用关键因子（蛋白）基因沉默的原代培养成骨细胞中的磷代谢利用（胫骨磷沉积、成骨细胞磷利用指数等），以及磷对肉仔鸡胫骨和以上原代培养细胞中关键局部调节因子（细胞外基质磷酸化糖蛋白、成纤维细胞生长因子23等）、骨形态发生蛋白（BMP）/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路关键激酶（蛋白）（p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶、细胞外信号调节激酶、BMP等）和基因沉默关键因子（蛋白）的mRNA及其翻译蛋白表达水平与上述激酶蛋白磷酸化水平的影响，从而系统、深入揭示肉鸡骨骼磷代谢利用规律及其分子机制，对于我国肉鸡生产中如何提高其饲粮磷利用效率，节约磷资源，降低饲料成本，以及减少磷排放对环境的污染，都具有重要理论与现实指导意义。

本项目5年执行期间，均按原计划高质量并超额完成了系列肉仔鸡自然饲喂体内试验和体外原代培养肉仔鸡胫骨成骨细胞试验，系统研究揭示了不同日龄与饲粮不同磷水平和添加维生素D3条件下肉仔鸡骨磷代谢利用规律及其与骨骼发育的关系，以及体外原代培养肉仔鸡胫骨成骨细胞的磷代谢利用规律，并深入研究揭示了相关分子机制，取得如下研究新成果：（1）发现肉仔鸡骨骼磷沉积利用随其日龄增长而线性和曲线增加，且可能通过调控骨骼碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素而影响肉仔鸡整个生长期的骨骼发育；（2）发现肉仔鸡骨磷代谢利用随饲粮磷水平提高而线性和曲线增加，可能与机体调控血清甲状旁腺素和1, 25-二羟基维生素D3、骨成纤维细胞生长因子23(FGF23)、X染色体内肽酶同源性磷酸调节基因(PHEX)和牙本质基质蛋白1(DMP1)及骨形态发生蛋白(BMP)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中细胞外调节蛋白激酶1(ERK1)和c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)的mRNA表达、骨BMP2蛋白表达以及ERK1蛋白的磷酸化有关，并可能通过调控血清钙和磷及骨骼ALP而影响肉仔鸡的骨骼发育；（3）成功构建了原代培养肉仔鸡胫骨成骨细胞模型，即以组织块培养法获得的细胞具备典型的成骨细胞形态学和生物学特征，且纯度较高（>95%）；（4）发现体外原代培养肉仔鸡胫骨成骨细胞磷代谢利用随磷添加水平的升高而线性和曲线增加，可能与DMP1、细胞外基质磷酸化糖蛋白（MEPE）、PHEX及BMP/MAPK信号通路中关键基因（BMP2和ERK1）mRNA表达、MEPE蛋白表达以及JNK1蛋白的磷酸化有关；（5）应用基因沉默及磷酸化抑制技术研究确认，DMP1、BMP2、ERK1和JNK1直接参与了肉仔鸡胫骨成骨细胞磷代谢利用调控，是促进肉仔鸡胫骨成骨细胞磷代谢利用的重要因子；（6）发现饲粮添加维生素D3促进了缺磷肉仔鸡肠道的磷吸收及骨骼磷利用，可能与饲粮缺磷时维生素D3分别促进了肉仔鸡十二指肠中无机磷转运载体1(PiT-1)的表达水平以及空肠中钠依赖性磷协同转运载体II b (NaP-II b)和PiT-1的表达水平有关。以上研究新成果对于肉鸡生产中如何提高其骨和饲粮中磷利用效率，节约磷资源以及减少磷排放对环境的污染，都具有重要理论与现实指导意义。