狂犬病病毒强、弱毒株感染原代神经元细胞的差异性研究

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabie virus, RV）引起的人兽共患中枢神经系统传染病，是迄今为止人类唯一病死率高达100%的急性传染病，严重威胁社会公共安全。目前，对狂犬病病毒的病原分子生物学、免疫学等方面的研究较多，但依然对此病毒的致病机理，特别是强、弱毒株在神经元细胞中的差异性感染的研究还不够。本项目拟建立原代神经元细胞的狂犬病病毒感染模型，通过差异蛋白质组学的方法揭示神经元细胞对强、弱毒株感染在蛋白表达和信号通路上的调控差异，并利用反向遗传操作等技术研究差异调控蛋白与病毒致病力的联系。本项目旨在阐释狂犬病毒强、弱毒株感染神经元细胞的不同调控模式，为进一步寻找潜在的用于RV感染诊断和治疗的分子靶标奠定基础。

为了全面比较狂犬病病毒强弱毒株的差异，本课题分别从强弱毒株的基因组序列、感染小鼠及神经细胞等不同水平开展研究及分析。利用生物信息学手段对世界范围内狂犬病病毒街毒株及弱毒株的基因组差异及遗传演化进行了分析，找到了一些中国野毒株的分子标记，分析发现狂犬病病毒基因组的地域特征强于宿主特征。分离并测定了华南地区一株猪源野毒株的基因组全序列，对猪源野毒、标准强毒、弱毒株在小鼠上的致病力、宿主适应性等方面进行了研究。我们在感染小鼠实验中发现，滴鼻感染后，标准强毒CVS-11能够100%致死小鼠，而弱毒Hep-Flury能够进入小鼠脑内并引起神经症状，但后期能够被宿主清除出大脑。为了探讨中枢神经系统在对抗强、弱毒感染的差异，我们利用RNA-Seq技术比较并分析了CVS-11和Hep-Flury滴鼻感染后小鼠脑中的全基因表达谱变化，发现强、弱毒株感染后能够引起脑内先天性免疫、炎症反应、抗原递呈、神经信号传导等相关的信号通路的差异性调控。一些与先天性免疫相关功能因子的调控在原代海马神经元细胞感染模型上得到了验证。通过分析发现，RIG-I、MDA5等模式识别受体相关的干扰素调节途径在病毒感染的早期起重要作用，弱毒株Hep-Flury能够更早地（感染后4天）显著上调RIG-I、MDA5、CXCL9、CXCL10、CD274等基因，而强毒CVS-11则在感染后7天才开始大大刺激干扰素及炎症相关的蛋白因子。相较于CVS-11，在Hep-Flury感染后第7天，小鼠脑内的CIITA、CD74、MHC-II、CD4、κ轻链等获得性免疫相关的因子出现更大幅度的提高，且持续到第10天。依据上述研究结果，我们认为弱毒株Hep-Flury能够更早地激活干扰素的抗病毒途径，且被其抑制，而强毒株CVS-11则较晚激活该途径并通过一些方式逃逸其抑制作用。同时，Hep-Flury能够比CVS-11更早更强地激活获得性免疫相关的信号通路。以上结果部分阐释了Hep-Flury进入鼠脑后能够被清除的免疫调控机理，为进一步研究狂犬病病毒强弱毒株致病性的差异奠定了基础。