基于质谱法的多巴胺反应性氧化产物蛋白加合物定量分析

Several unstable and electrophilicity reactive oxidation products of dopamine (ROPD) are formed after dopamine oxidation. The reactive oxidation products can modify the functional proteins and play an important role in the neurodegenerative processes of Parkinson’s disease. However, dopamine oxidation is a complex pathway and the most of products are very unstable, the ROPD profiling and their covalently modified protein levels in biological system is still unclear. It is difficult to study and separate the detailed role in Parkinson’s disease. Here we intended to develop a novel mass spectrometry based strategy for characterization the ROPD profiling by determine the stable ROPD-nucleophile adducts instead of unstable ROPD themselves. The macromolecular ROPD-protein adducts are subjected to Protease digestion to liberate micromolecular ROPD-amino acid residues adducts. The ROPD-protein adducts are quantified as corresponding ROPD-amino acid residues adducts by TSQ/MS in MRM mode. In additional, the quantitative conclusion will be validate by the pharmacodynamics studies. The quantitative method and ROPD--amino acid residues adducts as the chemical markers will be applied to study the influencing factors on the formation of ROPD, such as oxidative stress, heavy metal ions, ageing. This project will not only helpful for providing rationales, such as the proteins modification ability of ROPD in biological system, for the study of the detailed role of ROPD in the degenerative process occurring in Parkinson’s disease, but also providing quantification method of ROPD in biological system and several reliable chemical markers in these studies.

多巴胺经氧化后产生多种不稳定、具有亲电性的反应性氧化产物（ROPD）。ROPD能共价修饰多种蛋白，在帕金森病（PD）发病进程中具有重要作用。由于多巴胺的多途径氧化以及绝大多数ROPD极不稳定，导致生物体系中ROPD谱和各ROPD蛋白结合程度并不清楚。因此，很难研究和区分各ROPD在PD中的具体作用。本项目采用质谱法，利用ROPD能与亲核性物质形成稳定结合物的特点，结合蛋白酶解法，将大分子的ROPD蛋白结合物酶解成小分子的ROPD氨基酸结合物，通过间接定性稳定性小分子结合物的方法表征ROPD谱，纯化并定量生物体系中的ROPD蛋白结合物。最后，采用药理学实验验证定量结果，并应用建立的定量分析方法以及以ROPD氨基酸残基结合物作为化学标志物考察金属离子、氧化应激、衰老等因素对ROPD生成的影响。本项目将为ROPD在PD发病进程中的作用研究提供化学标志物、定量研究方法和ROPD结合蛋白能力信息。

帕金森病（PD）是一种多病因的中枢神经退行性疾病。越来越多证据表明神经递质多巴胺（DA）异常代谢生成的反应性氧化产物（ROPD）在帕金森病发病进程中发挥重要作用。由于RODP极不稳定而难以直接测定，导致生物体系中ROPD谱及其共价修饰蛋白的能力并不清楚。因此难以明确PD发生中的关键ROPD及其作用。本项目采用质谱法结合蛋白酶解法，将大分子的ROPD蛋白结合物酶解成小分子的ROPD氨基酸残基结合物以表征ROPD谱及关键ROPD，为ROPD在PD发病进程中的作用研究提供化学标志物、定量研究方法和ROPD结合蛋白能力信息。. 本项目结果表明DA在体外环境生成的ROPD较为复杂，可生成4种ROPD。然而，我们对蛋白酶解法进行了系统性优化，在PD动物模型大脑中仅发现二羟基苯乙醛（DOPAL）和和吲哚-5,6-醌（indole-5,6-quinone, IQ）能够共价修饰蛋白多种含伯氨的氨基酸残基。我们采用含有巯基及伯氨的模拟肽段考察DOPAL的共价结合能力和结合方式，发现DOPAL与氨基酸伯氨发生反应，而非巯基。通过定量分析发现脑内特别是纹状体DOPAL含量较高，达到10 μg/g浓度水平。基于以上结果，分别制备了公认的6-羟基多巴和鱼藤酮大鼠PD模型，脑内DOPAL和IQ在注射造模剂后数分钟显著升高并发生蛋白修饰，早于多巴胺能神经元的大量死亡，且纹状体蛋白结合水平远高于黑质和皮质区域，表明DOPAL和IQ的产生及共价修饰蛋白可能是各种因素引起PD发生的早期公共事件。该结果也为最近几年提出了PD发病机制的“儿茶醛假说”提供了坚实的生物化学证据。大鼠脑内注射DOPAL可造成多巴胺能神经元大量死亡并最终产生PD症状，提供了ROPD在PD发生关键作用的直接证据。. 综上所述，本项目结果表明本项目结果表明DOPAL和IQ作为关键性的ROPD在PD发生进程起到重要作用，为PD发病机制及相关药物靶点研究提供了理论依据。