基于转录组测序的腹黏菌亚纲和发网菌亚纲黏菌核糖体序列测定及分子系统学研究

Myxomycetes is a special group of creature which has the characters of both protozoan and fungus, and its Phylogenic studies had always received much attentions. Due to the poor sequence similarity between closely related species, it is difficult to amplification and sequence the DNA sequence of ribosome or EF1-a and others using traditional PCR method. And this lead to the situation that for most of the Myxomycetes species, phylogenic relationship can only be established by morphological other than molecular approach. In eukaryotes more than 90% of total RNA were ribosome RNA, and if we performed transcriptome sequencing for the total RNA of each Myxomycetes species, then the ribosome RNA sequence can be easily got by bioinformatics analysis. Transcriptome sequencing need not to know any sequence information before and can be carried out in any Myxomycetes species, it will be a good method to sequence the ribosome sequence of any Myxomycetes species, which will facilitate the Phylogenic research in Myxomycetes.

黏菌是一类特殊生物，兼具原生动物和菌物的特征，使得其系统发育一直被关注。但黏菌物种之间序列保守性较差，大部分物种在现有条件下通过PCR扩增等传统手段很难测定出其核糖体、EF1-a等基因的序列，由此导致大部分物种无法进行分子系统学分析。真核生物的转录物即总RNA中核糖体RNA占90%以上，如果提取某一黏菌物种的总RNA进行转录组测序，那么得到的数据中90%以上将是核糖体基因序列，通过相应的生物信息学软件将这些序列片段进行拼接就可以得到这一黏菌物种的核糖体序列全长。这一方法不需要预先知道任何序列信息，理论上适用于任何黏菌物种，可以解决某些黏菌物种无法获得核糖体基因序列的难题,并极大推动黏菌分子系统学研究。

本项目的主要研究内容是获得黏菌核糖体基因序列为研究黏菌系统进化服务，方法是应用二代测序的方法。本项目的研究思路为：黏菌是自然界中非常重要的一个类群，黏菌在动物类群和真菌类群分化之前就已经存在，是非常古老的一类生物。但长期以来黏菌研究较落后，一是由于黏菌个体较小，不易发现、采集；二是因为黏菌的进化历史非常古老，不同黏菌物种间的基因同源性非常差，再加上黏菌核糖体等序列中有大量的Group I内含子插入，传统上通过PCR同源克隆获得核糖体等基因序列的方法在黏菌中行不通，对核糖体等基因序列而言迄今都未能设计出通用引物，多数黏菌物种在现有条件下通过PCR扩增等传统手段很难测定出其核糖体等基因的序列。即使对于那些已经扩增出的序列，因为用了不同的引物导致扩增出的并不是同一段序列，由此对大部分黏菌物种来言无法进行恰当的分子系统学分析。二代测序技术的出现为这一难题的解决带了希望，二代测序的方法是将DNA或RNA打断成小片段构建文库然后进行测序，无需预先知道物种的序列信息，对于任何物种都可以测序。我们收集了绒泡菌目、团毛菌目、发网菌目和无丝菌目的共145种黏菌标本，以目为单位混合起来进行了基因组测序。从得到的数据中挖掘出了核糖体基因相关的reads，再通过Lasergene软件拼接，找到了保守区域。我们通过收集多达四个目共145种的黏菌标本，并且在可能的情况下对每一个物种的黏菌尽量放入尽可能多的、不同地区采集的标本，保证了数据的代表性，全面性。通过把核糖体基因划分为11段，我们成功设计了可以覆盖核糖体基因全长的11组通用引物。经过PCR及测序验证，结果正确，说明我们设计的引物成功了，我们的方法是可行的。我们还设计了两对扩增子测序专用引物，分别扩增18s和28是核糖体基因，通过初步PCR扩增，扩增效果良好，具体对于黏菌扩增子测序研究的适用性还需要等待具体的测序结果。在整理结果过程中我们把用到的145种黏菌的基因组大小、GC含量进行了测定，在国际上首次系统的构建了黏菌基因组大小和GC含量的数据库，明确了黏菌基因大小变化范围在20.22-470Mb之间，GC含量变化范围为38.76%-70.1%之间。