蛋白精氨酸甲基转移酶PRMT5和PRMT7对小鼠胚胎干细胞功能影响的研究

Protein arginine methyltransferase (PRMT): PRMT5 and PRMT7 are only known type II PRMTs that generate symmetrically dimethylated arginines (SDMA) on proteins including Sm-class proteins, histone H2A, H3 and H4. Our previous study and published results suggest that: PRMT5 is essential for murine ESC self-renewal and proliferation, partially by modifying histone H2A arginine 3 (H2AR3) to repress somatic gene expression to maintain a pluripotent state in ESC, indicating that certain dimethylated arginines on histones could be novel epigenetic repressive marks. Due to the result that both PRMT5 and PRMT7 can symmetrically methylate arginines on histones, it is possible that PRMT7 modifies the same or not the same histone substrates as PRMT5. This study aims to utilize inducible knock out (KO) ESC model of Prmt5 KO, Prmt7 KO or Prmt5/7 double KO to tear apart the role of PRMT5 and/or PRMT7 in modifying critical histones as well as how these histone marks affect ESC gene regulation and transposon repression, by testing the functional outcome of losing PRMT5, PRMT7 or both; examining changed levels of modified histones; investigating the enrichment of modified histones in the genome together with changes of gene expression and transposon de-repression. By means of research, we could uncover crucial basics of stem cell biology, which will provide important references and bases for reproductive medicine using ESC.

PRMT5/7是已知的二型精氨酸甲基转移酶，甲基化SM家族蛋白和组蛋白H4/3/2A，形成对称双甲基化精氨酸。前期研究结果表明PRMT5对小鼠胚胎干细胞自我更新起关键作用，其部分机制是通过修饰H2A第3位精氨酸残基H2AR3抑制体细胞基因表达，维持ESC多能性，表明甲基化组蛋白形成的特定双甲基化精氨酸可作为新型表观抑制标记物。PRMT5/7甲基化组蛋白形成对称甲基化精氨酸，两者甲基化相同或不同组蛋白。本研究利用诱导性单敲除及双敲除Prmt5/7的小鼠胚胎干细胞，区分两者在甲基化组蛋白过程中的不同作用，及甲基化组蛋白对小鼠ESC的基因调控和转座子抑制的影响。通过检测PRMT5/7缺失细胞功能的变化，如甲基化组蛋白的变化、基因组中甲基化组蛋白的富集度，基因表达和转座子抑制的变化，研究PRMT5/7在小鼠胚胎干细胞中的调控作用，以确定上述变化是由PRMT5/7是单敲除还是双敲除决定。

小鼠naïve状态的胚胎干细胞可在含有血清与LIF因子(serum+LIF)的培养基中，或含有双抑制因子与LIF因子(2i+LIF)的培养基中增殖生长。从功能上来看，这两种培养基中培养出的胚胎干细胞均能在动物体内形成嵌合体，然而它们各自的表观遗传及转录组特性并不相同。因此，对胚胎干细胞自我更新的调控机制可能存在培养基的依赖性。PRMT5/7是已知的二型精氨酸甲基转移酶，甲基化SM家族蛋白和组蛋白H4/3/2A，形成对称双甲基化精氨酸。前期研究结果表明PRMT5对小鼠胚胎干细胞自我更新起关键作用，其部分机制是通过修饰H2A第3位精氨酸残基H2AR3抑制体细胞基因表达，维持ESC多能性。为了探究培养基在胚胎干细胞调控中的作用，我们在小鼠胚胎干细胞中敲除了Prmt5。通过本研究，我们发现在2i+LIF培养基中培养的PRMT5缺失的胚胎干细胞存在G2/M细胞周期停滞及DNA损伤的现象，而在serum+LIF培养基中培养的PRMT5缺失的胚胎干细胞出现G2/M细胞周期停滞、碱性磷酸酶活性降低及分化基因表达升高的现象。PRMT5的一个主要的下游通路是促进Mdm4的正确剪切，而Mdm4能抑制P53的表达。我们随后敲除了Trp53（P53）基因，发现在这两种培养条件下均不能挽救表型。而当PRMT5缺失的胚胎干细胞与小鼠胚胎成纤维细胞共培养时，Prmt5突变的表型才得以修正。综上所述，Prmt5在调控胚胎干细胞多能性上受到所处培养环境的影响。当胚胎干细胞与胚胎成纤维细胞共培养时，PRMT5充当着调控干细胞自我更新的角色。本项目的研究结果提示在进行胚胎干细胞实验时，培养条件的选择及是否与胚胎成纤维细胞共培养是十分重要的。