丹参关键酶基因SmCPS特异性功能分析及其对丹参酮类成分合成的调控

丹参酮类有效成分是中药丹参中一类脂溶性二萜醌类化合物，丹参柯巴基焦磷酸合酶基因（SmCPS）是前期工作中克隆得到的具有自主知识产权的丹参二萜关键酶基因。为了精确鉴定SmCPS的功能，以及研究该基因在丹参生物体内是如何参与调控丹参酮类化合物形成，本项目拟采用已知催化功能的贝壳杉烯合酶（AtKS）和松香二烯合酶（AtAS）分别与SmCPS共催化GGPP的方法，通过对共催化产物的结构分析，确定SmCPS催化产物的立体化学结构，从而鉴定该基因的确切功能。在此基础上，从SmCPS基因过表达和表达抑制正反两个角度，通过构建该基因过表达和表达抑制载体，分别转化至丹参生物体内，结合丹参酮类化合物形成和积累的变化，阐明SmCPS基因在丹参酮类成分形成中的作用及其调控机制。本项研究为保护我国药用植物丹参的重要基因资源及其可持续利用研究提供科学依据，对于揭示丹参酮类成分形成的分子机制具有重要意义。

本项目以丹参酮类活性成分作为目标化合物，运用基因全长克隆及功能鉴定、基因过表达及RNA干扰等分子生物学技术和功能基因组学方法，针对丹参酮生物合成途径上重要的关键酶基因SmCPS进行了探索性研究，取得创新性结果如下：①SmCPS催化GGPP形成空间结构(+)-CPP，特异性功能鉴定为被子植物中首条(+)-CPP合成酶基因；根据SmCPS催化功能，将SmCPS成功用于丹参酮生物合成中间体次丹参酮二烯的合成生物学研究中，设计模块组合方式，通过对编码SmCPS等蛋白的基因进行了操作，发现二萜合酶SmCPS、SmKSL基因间融合表达及其融合顺序对产物产量有明显影响，最终得到的最优的工程菌株在15-L发酵罐中培养，次丹参酮二烯产量达到365 mg/L的国际先进水平。②SmCPS过表达可使转化丹参材料中SmCPS表达量显著升高，并且丹参酮类化合物中间体（次丹参酮二烯）及丹参酮类终产物（二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮）积累也随之增加；③ SmCPS表达沉默（RNAi）可以抑制丹参毛状根中SmCPS的表达和丹参酮类化合物的积累，特别是丹参酮IIA成分含量低至无法检测。研究结果表明SmCPS是丹参酮生物合成途径上极为重要关键酶基因，其表达水平调控着丹参酮类活性成分的积累。研究成果可用于构建SmCPS过表达载体转化获得高产丹参酮类活性成分的丹参转基因株系，为工业化获取丹参酮类药用原料提供更加经济的药材，并为合成生物学生产丹参酮类药用成分提供重要的调控靶基因；同时可用于丹参栽培过程中的监控，通过检测SmCPS基因表达水平规范调整栽培措施以及筛选高产丹参酮的丹参株系和品种。总之，项目成果将有助于系统阐明丹参活性成分形成的分子机制，填补了丹参酮生物合成GGPP下游途径的空白，SmCPS作为重要靶基因在中药分子育种及代谢工程、合成生物学等方面的应用，对于丹参分子育种、种质资源评价及有效成分生产具有重要意义。在本项目资助下，发表论文9篇，其中1篇被SCI收录（Yongjin J. Zhou, Wei Gao, Qixian Rong,et al. J. Am. Chem. Soc., IF 9.907），国内核心期刊论文8篇；形成2篇硕士学位论文；获得国家发明专利1项；培养博士1名、硕士2名，在读硕士研究生1名。项目负责人获2010年度全国优秀博士毕业论文，并获中华医学会科技进步奖二等奖1项。