固本化瘀通络法调控糖尿病肾病足细胞自噬异常的分子机制研究

Researches had confirmed that DN(Diabetic Nephropathy) was caused by podocyte damage, and the core pathological procedure was due to be podocyte abnormal autophagy, but the mechanism of which is not clear. We have proved that Guben Huayu Tongluo Principle was effctive to DN causing by "insufficient of both the spleen and the kidney and blood stasis and phlegm accumulation". On the basis of preliminary study on protein degradation duing to ubiquitination and endoplasmic reticulum stress(ERS), we assume that podocyte abnormal autophagy is the core pathological process of podocyte indury in DN, and Guben Huayu Tongluo Principle play a part in DN by regulating the overall pathological procedure. To verify the hypothesis, we will use H-2Kb-tsA58 transgenic mice podocye line and db/db mice to test changes on the form, number, activity of autophagosome and related gene, detect related protein for podocyte damage and apoptosis, chose mTOR, AMPK, Sirt1, Bcl-2-beclin-1, ERS and oxidative stress as the targets for autophagy regulation, and utilize several kinds of technique, such as confocal laser, immuno fluorescence, double staining flow cytometry, bioinformatics, etc. From all of above, we can explore the therapy target of Guben Huayu Tongluo Principle in DN, as well as the molecular mechanism and mode of cell signal regulation. This could provide new strategy of preventing and treating DN.

业已证实，糖尿病肾病（DN）是一种足细胞疾病，自噬异常是DN足细胞损伤的核心病理环节，但其机制尚未明确。本研究在固本化瘀通络法治疗以"脾肾亏虚、痰瘀互结、脉络阻滞"为关键病机的DN取得确切疗效的基础上，基于前期对蛋白泛素化降解和内质网应激的研究积累，提出"自噬异常是DN足细胞损伤的核心病机，固本化瘀通络法基于整体性调控该环节而起效"之假说。以H-2Kb-tsA58 转基因小鼠足细胞株为细胞模型、db/db小鼠为在体模型，以足突蛋白和凋亡为足细胞损伤的标志，以自噬体的形态、数量、活性及相关基因为自噬改变的指标，以mTOR、AMPK、Sirt1、Bcl-2-beclin-1、ERS和氧化应激为自噬信号调控通路,利用激光共聚焦+免疫荧光、双染流式细胞术及生物信息学等研究手段,从整体、细胞及分子水平研究固本化瘀通络法治疗DN的作用靶点、分子药理学机制和自噬信号通路调控模式，拟为DN防治提供新策略。

糖尿病肾病( Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病（Diabetic mellitus, DM）最严重的并发症之一；足细胞损伤是糖尿病肾病发生的始动环节，足细胞内大量异常蛋白和细胞器积聚是糖尿病肾病足细胞损伤的病理学基础，而自噬异常是糖尿病肾病足细胞损伤核心病理环节。前期研究表明固本化瘀通络合剂可维持STZ诱导的糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin、podocin蛋白的正常表达，稳定足细胞形态和功能，从而减少糖尿病肾病大鼠的尿白蛋白排泄率。本研究在国家基金委的资助下，以“自噬异常是糖尿病肾病足细胞损伤的核心病理机制，固本化瘀通络法基于整体性调控该环节而起效”为假说与研究切入点，探讨固本化瘀通络法调控糖尿病肾病足细胞自噬异常的分子机制研究。. 主要研究内容：①高糖对肾小球足细胞自噬能力、自噬信号通路的调控的影响②固本化瘀通络法对高糖环境下肾小球损伤的保护作用及细胞自噬信号调控模式的研究③STZ诱导的2型糖尿病大鼠肾小球足细胞自噬异常的动态规律研究④固本化瘀通络法对STZ诱导的2型糖尿病大鼠肾小球足细胞损伤的保护作用及细胞自噬信号调控模式的研究。. 研究结果显示：①高糖抑制足细胞自噬活性，固本化瘀通络合剂含药血清可增加p-AMPK水平、降低mTOR的表达，并作用于Beclin1，进一步调节AMPK和mTOR信号通路；②固本化瘀通络合剂含药血清能够改善高糖环境下足细胞Sirt1的表达异常；③固本化瘀通络合剂可降低STZ诱导的2型糖尿病大鼠尿液中ACR值，改善其肾脏病理情况；④固本化瘀通络合剂对STZ诱导的2型糖尿病大鼠mTOR、SIRT1、AMPK有明显调控作用，而对Beclin1、Bcl2作用不显著。. 以上研究表明，固本化瘀通合剂可能是通过调控mTOR、SIRT1、AMPK等信号通路途径促进自噬小体的形成和自噬底物的降解，改善高糖环境下足细胞的自噬异常，抑制足细胞损伤和凋亡，从而起到保护肾脏、足细胞与调节细胞自噬的作用。初步揭示了“固本化瘀通络法”治疗糖尿病肾病蛋白尿的作用靶点和分子药理学机制，为阐明“固本化瘀通络法”干预糖尿病肾病足细胞损伤的自噬信号通路的调控模式打下基础。