新型靶向性外泌体运载miR-21治疗心肌缺血再灌注损伤的研究

miR-21 has been shown to be a promising therapeutic target for cardiac ischemia/reperfusion injury. However, the current delivery strategies using the traditional gene therapy vectors are associated with toxicity, off-target effects, inefficient gene delivery, short half-life of gene-carrier complex, and adverse immune reactions. In our preliminary research, a 9-AA peptide that could specially home to ischemia/reperfusion injured cardiomyocytes was displayed on the surface of exosomes using genetic engineering. Hence, we propose, for the first time, to create an exosome-mediated delivery vehicle that possesses the capability targeting to ischemia/reperfusion injured cardiomyocytes, high efficiency, negligible toxicity, non-tumorigenicity, and low immunogenicity. As a proof of concept, miR-21 will be tested in a mouse cardiac ischemia/reperfusion injury model. The targeting capability will be evaluated through observing the distribution of fluorescent-labeled miRNA in various tissues and organs, and the therapeutic effect will be assessed by monitoring cardiac function, myocardial infarction area, and the expression of known miR-21 target genes. If approved, this newly-developed therapeutic delivery vehicle could be explored as an ideal gene delivery vehicle for personalized and precision therapy in myocardial ischemia/reperfusion injury.

miR-21已被证实能缩小缺血再灌注损伤（IRI）心肌梗死面积，靶向运送miR-21将有潜在的治疗作用。但传统载体靶向运送效率低，且有载体毒性，易引起炎症及免疫反应。外泌体是纳米尺寸的新型基因转运载体，安全高效，可穿透生物屏障，生物相容性好。本研究前期发现用基因工程技术在外泌体表面展示一个能特异结合缺血心肌的九肽后，可使其靶向结合缺氧/复氧损伤的心肌细胞。因此我们提出，将此基因工程外泌体作为运送载体，向缺血心肌靶向运送miR-21，将能避免传统载体的上述缺陷，并发挥重要的治疗作用。本项目拟将装载miR-21的靶向外泌体尾静脉给入心脏IRI小鼠及缺氧/复氧损伤的心肌细胞，通过监测荧光标记的外泌体的组织分布，研究其靶向运送效果；通过检测心肌细胞凋亡、心肌梗死面积、心功能、血清酶活性和miR-21靶基因的表达，研究靶向运送miR-21的治疗作用，旨在为心肌IRI的精准治疗提供新的思路和技术平台。

心血管疾病是人类死亡的主要原因。药物的心脏靶向运送技术尚待研究开发。传统的药物运送载体缺乏靶向性，且有载体毒性，易引起炎症及免疫反应等。因此，研发新型、安全、高效的心脏靶向运送系统对心血管疾病的治疗具有重要的意义。外泌体是细胞分泌的、纳米尺寸、含脂质双层膜、并包裹了各种胞内信号分子的囊泡，是‘细胞-细胞’通讯的重要方式之一。此外，外泌体具有良好的生物相容性、低免疫原性、低致瘤性、可穿透生物屏障等优点。因此外泌体有望成为新一代的药物运送载体。本研究利用基因工程技术将能特异结合缺血心肌细胞的归巢肽成功地展示在外泌体表面，该外泌体能靶向结合缺氧/复氧损伤的心肌细胞。因此本项目利用基因工程技术、小动物活体成像、激光共聚焦、流式细胞术、小动物心脏超声等技术分别在整体动物、细胞及分子水平系统分析了该外泌体对缺氧/复氧损伤心肌的靶向运送效果及治疗作用。.实验结果表明：装载大量具有心肌保护性miRNA-21后，该外泌体可以靶向结合缺血心肌、显著抑制缺氧/复氧损伤造成的心肌细胞凋亡，能够显著改善心肌缺血/再灌注损伤小鼠的心脏功能。其次，本项目用人心肌球源性细胞成功制备了靶向心脏的基因工程外泌体，该外泌体可以显著提高心肌球源性细胞外泌体的心肌保护作用、显著抑制主动脉缩窄诱导的小鼠心肌肥厚、降低小鼠动脉血压、改善小鼠心脏功能、抑制心肌纤维化及心衰。本项目成功建立了靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞及靶向广泛心肌的靶向外泌体运送系统，为心血管疾病的靶向治疗及精准治疗提供了新的思路和技术平台。此外，我们利用HEK293细胞建立了外泌体大量装载人食管癌相关基因4（ECRG4）mRNA的制备方法，该外泌体能够显著抑制小鼠口腔鳞癌细胞及移植瘤生长。