龙眼蛋白多糖的吸收利用及免疫调节活性的构效机制研究

The previous studies have confirmed that crude longan pulp proteoglycans possessed beneficial functions for mouse immune system, and their four purified factions displayed significant differences in structural feature and immunostimulatory activity in vitro. However, the uptake, utilization, immunomodulatory activity in vivo and potential structure-effect relationship of the polysaccharide factions remain unclear. The present research purposes to establish the microanalysis of longan proteoglycan fractions as fluorescent labeled derivatives by high performance gel permeation chromatography, measure the concentration related kinetic parameters and molecular weight distribution of the factions in mouse blood, tissue, organ and excretion after intragastric administration, and then reveal their in vivo behaviors including uptake, distribution, degradation and excretion. Moreover, the effects of peroral administrated longan proteoglycan fractions on the immune organ index, immunocyte function and cytokine secretion in serum of normal mice will be analyzed. Further, the in vivo relationships among the structure, uptake, utilization, and immunomodulatory activity for longan proteoglycan will be deduced, and the main active faction can be identified. The active faction will be degraded by different tissue homogenate incubation to obtain new sub-fractions. Their primary and higher structural features and immunostimulating activities on immunocyte will be analyzed to investigate the effects of structure on in vitro immunostimulation. Based on the above research, the structure-effect relationship in the uptake, utilization and immunomodulatory activity of longan proteoglycan can be concluded. This project will provide theoretical basis for the fine processing of longan fruit and provide new knowledge for the bioactive mechanism elucidation of other botanic polysaccharides and proteoglycans.

前期研究发现龙眼果肉粗蛋白多糖能调节机体免疫功能，且其4个主要级分的结构特征和体外免疫刺激活性呈显著差异，但级分体内吸收利用及免疫调节的构效机制尚不清楚。本项目拟建立龙眼蛋白多糖各级分的荧光标记及高效凝胶渗透色谱分析法，通过分析各级分灌胃后在小鼠血液、组织器官和排泄物中的浓度动力学参数及分子量分布，探明其体内吸收、分布、降解和排泄行为；通过分析各级分灌胃后对小鼠免疫器官指数、免疫细胞功能和血清细胞因子表达的影响，探讨其结构特征-吸收利用-免疫调节的体内构效关系，并明确其主活性级分；通过主活性级分的体外模拟孵育降解实验，分离制备各降解级分，表征其一级和高级结构特征，分析其免疫细胞刺激活性，探讨结构变化对其体外免疫刺激的影响。研究揭示龙眼蛋白多糖结构与吸收利用和免疫调节的体内外构效机制，旨为龙眼精深加工提供理论依据，为果蔬多糖生物活性机制研究提供新思路。

蛋白多糖是龙眼肉免疫调节的主要功能因子，其研究尚局限于少数组分的分离纯化、结构解析和体内外活性评价。本项目探析龙眼蛋白多糖的体内吸收利用及体外免疫刺激的构效关系与分子机制，以进一步明晰其药动学和药效学特征。1）通过FITC标记制备具有荧光特征的龙眼蛋白多糖LPPF，采用HPSEC-FD法考察其在小鼠生物样本中的特异性，经方法学评价后用于血浆、脾和肺中LPPF定量和定性分析。2）LPPF（40mg/kg体重）由小鼠尾静脉注射后，监测5–360min内血浆、脾和肺中浓度变化发现，血药浓度-时间曲线拟合典型的二室模型，半衰期（t1/2α 2.23min，t1/2β 39.11min）和平均滞留时间（MRT0–t 1.15h，MRT0–∞ 1.39h）较短，在脾、肺和肝中蓄积浓度较少，主要由肾快速排除。3）主活性级分LPII选择性刺激B淋巴细胞和巨噬细胞活化，且经蛋白酶适度降解后的刺激活性显著增强，但对T细胞无明显刺激作用，与其免疫细胞受体的特异性识别有关。4）纯化制备主要由→6)-Glc-(1→、→5)-Ara-(1→、→4)-Man-(1→和→6)-Gal-(1→组成的分子量44.7kDa的亚级分LPIIa，发现其巨噬细胞刺激效应在受体TLR4或TLR2阻断后显著减弱，相似效果亦在p38 MAPKs、PKC、PTK、PI3K或NF-κB被特异性抑制后发生，推测刺激信号经TLR4/2触发并由p38 MAPKs和NF-κB通路转导。5）从新鲜和干制果肉中分离的蛋白多糖LPF和LPD的理化特征存在显著差异，相较之下LPD具有较高的结合蛋白含量、较强的蛋白结合力以及较强的免疫细胞刺激活性，而结合蛋白的超声解离均伴随活性的减弱。6）分离不同干燥阶段果肉中粗多糖，经HPSEC-UV分析发现多糖-蛋白质复合物通过美拉德反应形成于果肉干燥过程。将多糖和蛋白质混合物置于干热条件下反应1–6 d，结合游离氨基含量、紫外-可见光谱、红外光谱和分子量的动态变化确证了两者的美拉德反应，且共价结合有利于增强其免疫刺激活性，但反应后期产生的降解可能导致活性减弱。项目研究的意义在于：明晰龙眼蛋白多糖药代动力学行为及免疫刺激信号通路，丰富其生物作用机理；探明多糖与蛋白质的美拉德相互作用及其活性影响，为果肉干制营养品质控制提供依据；基于降解和结合阐释蛋白多糖免疫刺激的构效关系，为多糖的理化改性提供新思路。