以AAV8为平台转染TLR4胞内区TIR竞争性结合多肽基因对小鼠肝脏热缺血－再灌注损伤的保护作用

在肝脏缺血－再灌注损伤中TLR4起重要作用，但其信号传导途径仍未完全明了，阻断其信号传导通路是防治肝脏缺血－再灌注损伤的关键。本课题首先将明确小鼠肝脏热缺血－再灌注损伤中TLR4信号传递是否依赖MyD88途经和/或IRF3途经；其次，通过基因治疗手段，在肝脏缺血－再灌注损伤中特异性、靶向性地阻断肝细胞TLR4信号传导。比对分析TLR4胞内区TIR结构域与下游衔接子TIR结构域基因序列，设计并筛选具有生物活性的TIR特异性竞争结合多肽，选用对肝细胞有较好亲和力的AAV8载体包装该多肽基因，使该蛋白多肽能在肝组织细胞内靶向性地稳定表达，并通过体外细胞实验及肝脏热缺血－再灌注模型来证实该多肽在阻断细胞内TLR4信号传导和下游转录因子激活中的作用，并考察AAV8载体在这一应用中的安全性和有效性，为该技术在临床防治肝脏缺血－再灌注损伤提供可靠的临床前实验研究。本课题研究内容在国内、外未见类似报道。

在肝脏缺血－再灌注损伤中TLR4起重要作用，阻断其信号传导通路是防治肝脏缺血－再灌注损伤的关键。本研究在小鼠肝脏热缺血－再灌注中证实TLR4信号传导通路介导了p-NF-κB p65的活化，造成了其后肝脏损伤；设计了能与TLR4胞内区TIR结构域结合多肽的共源基因序列，构建了带目的基因的pTIR-IRES2-EGFP质粒，在小鼠肝脏热缺血-再灌注模型中已证实TLR4胞内区TIR结构域竞争性结合多肽基因序列介导肝脏热缺血-再灌注损伤的保护作用。通过抑制NF-κB，JNK、p38 MAPK和 Caspase-3的激活，减少肝脏炎症反应和肝细胞凋亡。此项研究在国内、外首次将TLR4胞内区TIR结构域作为靶目标设计了鼠源性TLR4胞内区TIR竞争性结合多肽基因序列，并成功构建目的基因质粒；在国内、外首次证实带TLR4胞内区TIR结构域竞争性结合多肽基因序列质粒转染可通过阻断TLR4信号通路对小鼠肝脏热缺血-再灌注损伤具有保护作用。