USP47去泛素化调控PRDX1在放射性肝损伤中的作用及机制研究

Effective prevention and treatment of radiation-induced liver damage（RILD）is fundamental for enhancing the efficacy of radiotherapy for abdominal maligancies, including hepatocellular carcinoma (HCC). The occurence and progression of radiation-induced liver damage is closely related to reactive oxygen species- (ROS). In our preliminary study, we found that the expression of deubiquitinating enzyme 47（USP47）was significantly increased in irradiated liver tissues by proteomic approach, indicating its involvement in the regulation of radiation-induced liver damage. We further found that USP47 could bind to antioxidant peroxiredoxin-1（PRDX1）, resulting in an increased expression of PRDX1 and thus modulated ROS level. Based on the above findings, we hypothesize that USP47 may regulate the progression of radiation-induced liver damage by modulating the expression of PRDX1. This project will use multiple molecular biological methods and USP47 knock-out mice to illustrate the following issues: 1）The role of USP47 in regulating the radiosensitivity of liver cells; 2) The molecular mechanism of PRDX1 regulated by USP47 in the elimination of radiation-induced ROS. This project aims to illustrate the influence and mechanism of USP47-PRDX1 axis in regulating radiation-induced ROS and consequent radiation-induced liver damage, which is very likely to provide a novel strategy for the prevention and treatment of radiation-induced liver damage.

有效防治放射性肝损伤（RILD）对肝癌等肿瘤放疗的顺利进行及疗效提升具有重要意义。放射性肝损伤的发生发展与自由基危害密切相关。本课题组前期通过蛋白质组学等手段发现去泛素化酶USP47在受照射肝脏组织中显著升高，提示其可能参与放射性肝损伤的调控。初步研究表明：USP47能与抗氧化酶PRDX1相互作用并增加PRDX1表达，同时受照肝细胞自由基水平下降。基于此，我们创新性地提出本研究假说：USP47可去泛素化作用PRDX1调控受照射肝细胞的自由基水平及放射敏感性从而影响肝损伤进程。本项目拟在前期研究基础上通过多种分子生物学手段及USP47基因敲除小鼠明确：1）USP47对肝脏细胞及组织放射敏感性的影响；2）USP47结合并去泛素化稳定PRDX1影响自由基水平的分子机制。本研究有望从USP47-PRDX1调控自由基清除的角度揭示影响放射性肝损伤的新机制，为放射性肝损伤的防治提供新的理论依据和策略。

放射性肝损伤（radiation-induced liver damage，RILD）是肝癌等腹部恶性肿瘤放疗后最严重的并发症之一，极大地影响了肿瘤患者的生活质量及治疗效果。如何有效防治放射性肝损伤并揭示其发生发展的相关机制具有极为重要的临床价值。鉴于放射性肝损伤的发生发展与活性氧自由基（ROS）引起的细胞损伤密切相关，本项目在成功构建基于射波刀放疗的家兔放射性肝损伤模型的基础上，通过多种分子生物学手段检测了损伤肝组织中蛋白表达及通路活化情况。其中筛选出过表达的去泛素化酶47（deubiquitinating enzyme 47，USP47），并经细胞实验证实了USP47过表达可降低胞内ROS水平，同时USP47表达与放疗剂量呈正相关性。我们进一步通过串联亲和纯化/质谱技术鉴定出与USP47相互作用的抗氧化酶PRDX1。并通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位技术验证了USP47与PRDX1的相互作用。同时我们通过针对性剪切掉USP47催化功能域中的主要片段来探索USP47去泛素化调控PRDX1的功能域，包括全功能域剪切，Cys-box剪切，QQD-box剪切及His-box剪切。最后发现剪切后的USP47与PRDX1的相互作用均有所减弱，从而揭示了USP47去泛素化调控PRDX1的主要结构域。在构建过表达USP47或过表达PRDX1的肝细胞株后，本项目研究发现过表达USP47或过表达PRDX1的肝细胞经放疗后均显示出降低的ROS水平以及降低的凋亡水平，我们考虑这是由于高表达的USP47可以通过去泛素化作用稳定胞内PRDX1的蛋白水平而调控放射性肝损伤的发生发展。我们后续进一步构建了USP47基因缺陷小鼠来验证USP47缺失对放射性肝损伤程度的影响。结果表明USP47缺失的肝组织在放疗后出现转氨酶水平及炎症因子水平的升高，肝脏组织出现明显的肝细胞水肿等放射性损伤表现。这也证实了USP47在放射性肝损伤修复中的关键作用。因此根据本项目的研究结果，我们揭示了USP47去泛素化酶通过调控抗氧化酶PRDX1稳定性而维持细胞对自由基清除能力，从而减轻放射性肝损伤的发生与发展。而且USP47可作为临床预测放射性肝损伤风险的有效标志物，也具备成为放射性肝损伤治疗靶点的潜力。