转录因子NFAT5在渗透压应激影响肝癌细胞凋亡中的作用机制研究

It is critical to understand the underlying molecular mechanisms of the development of hepatocellular carcinoma (HCC) which is a malignant seriously threatening people's life. Recently evidences suggest that osmotic stress play an important role in inflammation and tumorigenesis. Nuclear factor of activated T-cells5 (NFAT5) is one of nuclear factor of activated T-cells family member, which is only mammalian osmotic regulator. In our previous work, we found that hyperosmotic stress induced hepatoma cell apoptosis through up-regulating the expression of NFAT5, which was related to the change of the SAM homeostasis level. We speculate the molecular mechanism of this phenomenon may be due to that hyperosmotic stress reduces the activity of MAT2A through promoting the expression of NFAT5, which result in increasing of the SAM homeostasis in HCC. In order to prove our hypothesis, we will make use of molecular biochemistrical techniques to investigate the influence of NFAT5 on hepatoma cell apoptosis both in vitro and vivo. We will study the epigenetical regulation mechanisms of NFAT5 undergoing osmotic stress by the stategy of promoter analysis 、methylation analysis and chip technique in hepatoma cells. We will also uncover the interactions mechanism between NFAT5 and MAT2A by CHIP. In conclusion, the aim of this research is to find the influence mechanisms of osmotic stress in tumor microenvironment on hepatoma cell apoptosis and to provide a new molecular targeted therapy in HCC.

肝细胞肝癌是严重危害人类生命的恶性肿瘤，揭示其分子发病机制极为重要。渗透压应激在炎症、肿瘤发生发展过程中发挥作用。作为渗透压调节剂转录因子NFAT5是NF-κB和NFAT家族最新发现的成员。我们在前期研究中发现，肝癌细胞微环境渗透压应激通过调节NFAT5表达对肝癌细胞凋亡产生影响，并与细胞稳态S腺苷蛋氨酸（SAM）浓度有关。我们推测在这一现象的机制在于肝癌细胞微环境渗透压应激通过NFAT5通路调控MAT2A的表达，导致细胞稳态SAM浓度变化，进而影响肝癌细胞的凋亡。为印证这一推测，本课题将采用分子生物学技术体内、外研究NFAT5对肝癌细胞凋亡的影响，用启动子分析、DNA甲基化分析及CHIP技术研究NFAT5基因表达调控的表观遗传机制，并用CHIP等技术研究NFAT5和MAT2A的相互作用。最终明确肝癌发生过程中渗透压应激对肝癌细胞凋亡的影响机制，为肝癌的分子靶向治疗提供新的靶位点。

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC)是严重危害人类生命的恶性肿瘤，揭示其分子发病机制极为重要和迫切。转录因子NFAT家族由于在癌症进展中的作用已经被得到足够的重视。NFAT5也被称作TonEBP 或者 OREBP（tonicity responsive enhancer binding protein），是哺乳动物的渗透压调节者。目前研究认为，渗透压应激在炎症、肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。因此，我们有理由猜想肝癌的发生、发展可能与肝组织渗透压应激相关。我们分四部分对NFAT5在乙肝病毒性肝癌发生发展中的作用进行了研究。我们发现，高渗应激能上调肝癌细胞NFAT5的表达，诱导肝癌细胞凋亡，并抑制细胞增殖。进一步发现NFAT5通过诱发caspase3、7、8表达对肝癌细胞系Huh7发挥明显促凋亡作 用，且这种促凋亡作用具有并具有时间效应。然而，NFAT5而对正常肝细胞系LO2细胞无明显促凋亡作用。由于乙肝病毒（HBV）是肝癌的主要诱发因素，我们探讨了HBV对NFAT5诱导肝癌细胞凋亡作用的影响及其机制。HBV对NFAT5在mRNA水平和蛋白水平均有明显抑制作用。其主要机制是通过 HBV对NFAT5启动子促甲基化作用实现的。HBV的X蛋白（HBX）可以通过与NFAT5启动子区AP1位点的结合抑制NFAT5转录，从而抑制NFAT5表达。我们的研究同时显示，HBx除了对NFAT5的直接作用，还可以通过miR-30e-5p/NFAT5/DARS2通路影响肝癌细胞凋亡。我们通过对高低不同复制力的乙肝病毒相关性肝癌样本全基因组小RNA测序，发现小核仁RNA宿主基因SNHG6能调控肝癌稳态SAM浓度。我们发现miRNA-1297可以抑制FUS和MAT2A的mRNA表达。同时发现FUS可以直接抑制MAT1A的蛋白表达，从而影响肝癌细胞稳态SAM浓度，进而影响肝癌细胞全基因组低甲基化改变。另外，我们对SNHG6另外一个靶蛋白的生物学意义进行了研究，结果提示UPF1的表达失调致HCC 进程中NMD作用减弱，进而引起TGF-β/Smad 通路核心因子Smad7的表达失调，进而诱发TGF-β/Smad通路失衡，最终导致HCC的侵袭转移。这些研究部分解释了NFAD5在肝癌发生发展中的作用，为肝癌的靶向治疗提供新的靶位点。