ESRD时肠道毒素对肠上皮细胞紧密连接影响机制的研究

The microbial metabolic toxins phenols and indole in ESRD lead to intestinal epithelial tight junction damage. In ESRD, These remain unclear whether the disordered intestinal flora, prolonged colonic transportation and the changed diet ingredient result in increased type and quantity of these intestinal toxins, and whether the increased toxin further damage tight junctions of intestinal epithelial cells. If any, the mechanisms of injury is unclear. LC/MS will be used for determination of metabolomics and proteomics, revealing difference of metabolite spectrum and protein profiles in fecal extract between ESRD rats and control rats, and in healthy people and ESRD patients, and obtaining representative toxin in the ESRD rats and patients; through the detection of the content and position change of tight junction protein: occludin, claudins, ZO-1 in cultured epithelial cells and the change of resistance of epithelial cell layer after expose epithelial cell layer to the known and representative toxin, the status of the epithelial barrier will be observed; using RNA interference, signaling pathway inhibitors, and other molecular biology method, P38 MAPK will be analyzed, revealing the molecular mechanisms of epithelial tight junctions damage after the toxin expose; the effect of orally active carbon on intestinal epithelial permeability in ESRD rats will be assessed, which lays a theoretical foundation for reducing the influence of toxin on the original disease.

ESRD时的微生物代谢性毒素酚类、吲哚导致肠道上皮细胞紧密连接损伤。ESRD的肠道菌群紊乱、结肠转运时间延长、饮食结构的变化是否会使这些肠道毒素的种类和量增多，增多的毒素是否会更进一步损伤肠上皮细胞的紧密连接，损伤的机制如何尚不清楚。本课题运用联用UPLC/MS 的代谢组学和蛋白质组学方法，揭示ESRD大鼠和患者粪便提取液代谢产物谱和蛋白谱的差异，获得ESRD大鼠和患者肠道毒素谱；将已知的和代表性毒素与肠上皮T84细胞共培养，检测紧密连结蛋白Occludin 、Claudins及ZO-1含量及位置的变化、上皮细胞层电阻的改变以确定其对上皮屏障的破坏；运用RNA干扰，信号通路抑制剂等方法检测p38 MAPKs通路，确定其在肠道毒素导致紧密连接蛋白破坏的主导作用，揭示毒素对上皮紧密连接破坏的分子机制；评估ESRD大鼠口服活性炭吸附剂对肠上皮通透性的影响，为临床减轻毒素对疾病的影响奠定理论基础。

我们前期研究发现在尿毒症状态下存在菌群紊乱；部分肠源性毒素可导致肠道上皮细胞紧密连接受损。但是失调的肠道菌群如何增加血中毒素水平，以及升高的毒素是否能进一步损伤肠上皮细胞的紧密连接，其中所隐含的机制却不甚明确。本研究中首次基于新兴的超高效液相色谱/质谱联用（UPLC/MS）方法分别对正常大鼠、ESRD 大鼠以及尿毒症患者和健康人群的粪便分别进行代谢谱和蛋白质谱的检测，从动物实验延伸到临床研究，进而筛选出一系列表达差异的代表性毒素，对尿毒症患者的血毒素谱有一全面认识。同时，基于尿毒症模型及取肠上皮细胞Caco2进行体内外实验，探讨尿毒症代表性毒素同型半胱氨酸对尿毒症大鼠肠道通透性及肠上皮屏障结构紧密连接的影响。此外，由于益生菌具有调节肠道菌群的作用，我们基于尿毒症大鼠模型及维持性血液透析患者，分别进行动物干预及随机对照的临床研究，深入探讨了益生菌对肠道屏障功能的保护作用，以及对降低肠道及血中尿毒症毒素及改善微炎症状态的作用，并且对益生菌清除尿毒症毒素的可能机制进行探索。通过以上方法，我们发现在尿毒症状态下，肠道菌群谱、血清及肠道毒素谱均发生了显著改变，尿毒症肠道菌群的多样性显著下降，而包括同型半胱氨酸在内的多种毒素水平则显著升高；尿毒症毒素同型半胱氨酸可能通过激活 p38 MAPK-ATF-2-MLCK-MLC/pMLC 通路从而增加肠道氧化炎症水平，导致肠上皮细胞紧密连接损伤及肠道通透性增加；补充益生菌制剂能够显著降低部分肠源性尿毒症潴留物质的水平；在肠道菌群方面，益生菌制剂虽然未能整体提高尿毒症患者肠道菌群的物种多样性，但是在恢复血液透析患者肠道菌群结构的平衡上发挥了一定作用，抑制了肠道中消化链球菌科和胃瘤球菌科的过度生长，此外，我们亦发现尿毒症潴留物质的减少与肠道细菌丰度的改变密切相关，这为将来探索益生菌清除尿毒症毒素的机制提供了基础。以上研究有助于益生菌治疗效果的进一步明确和肯定，为将来开展以肠道为靶点清除毒素的相关治疗策略提供理论依据，有很好的临床应用价值。