断奶应激损伤仔猪肠上皮细胞紧密连接的机理研究

断奶应激使仔猪肠黏膜屏障和肠上皮细胞紧密连接受损，其机理和信号转导机制不明。本研究拟开展仔猪饲养试验和大肠杆菌K88感染后的受损仔猪小肠上皮细胞培养实验，通过p38、ERK等信号通路抑制剂阻断MAPK信号转导通路，采用Ussing chamber、硝酸镧示踪电镜细胞化学技术和电镜冷冻蚀刻技术、实时荧光定量PCR、Western blotting、免疫荧光- - 激光共聚焦显微镜观察等方法，研究断奶应激对仔猪肠黏膜屏障、肠上皮细胞紧密连接以及紧密连接蛋白表达、定位和重构、蛋白磷酸化的影响及参与其中的信号转导机制，探明紧密连接蛋白磷酸化修饰和MAPK信号通路对断奶应激致肠上皮细胞紧密连接受损过程的调控机制，阐明断奶应激损伤仔猪肠黏膜屏障的分子机理，在基础理论方面会有原始性创新，而且可为在分子水平开展肠黏膜屏障功能的营养调控研究提供新的靶点，为防治"仔猪早期断奶综合症"开辟一条新思路。

在畜牧生产上，因断奶应激造成的仔猪胃肠道粘膜损伤是困扰仔猪高效生产的世界性难题。紧密连接是肠上皮细胞间的主要连接方式，对维持肠黏膜屏障具有至关重要的作用。断奶应激会造成仔猪肠黏膜屏障和肠上皮细胞紧密连接受损，但其机理和信号转导机制不明。探明断奶应激损伤肠上皮细胞紧密连接的具体过程和作用机制有助于为防治仔猪断奶应激开辟新思路。本研究通过仔猪饲养试验和大肠杆菌K88感染后的受损仔猪小肠上皮细胞实验，采用Ussing chamber、光镜电镜、荧光定量PCR、Western blotting等方法，研究了断奶应激以及氧化锌和丁酸对仔猪肠黏膜屏障、肠上皮细胞紧密连接以及紧密连接蛋白表达的影响，以及断奶后丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路中p38，JNK 和ERK 活化情况和细胞因子表达水平的变化；并通过p38、ERK、JNK等信号通路抑制剂抑制MAPKs信号通路，探究了MAPK信号通路对断奶应激致肠上皮细胞紧密连接受损过程的调控机制。本研究发现：断奶应激使仔猪肠形态和上皮屏障受损，通透性增加明显先于形态学变化，在断奶应激导致仔猪肠黏膜形态出现明显损伤之前，肠上皮通透性增高己经发生；但是，肠黏膜损伤修复过程中肠道通透性的恢复却滞后于形态学重建。仔猪断奶后，肠上皮细胞紧密连接受损，电镜下可见紧密连接不连续；紧密连接蛋白Occludin、claudin-1、ZO-1表达降低；上述现象在断奶后2周还没有恢复，而此时肠形态已经基本恢复，表明肠上皮屏障功能的重建还未完全完成。断奶会激活MAPKs信号通路，显著增加肠黏膜p-p38/ p38、p-JNK/JNK 和p-ERK/ERK磷酸化比值，断奶后3天p-p38/p38、p-JNK/JNK 和p-ERK/ERK 值达到高峰，随后磷酸化比值随着日龄的延长逐渐降低。在断奶应激致仔猪肠黏膜屏障受损过程中，抑制p38和JNK通路后，肠屏障得到改善，而抑制ERK1/2通路后，肠屏障损伤有加重的趋势。断奶应激对仔猪肠黏膜细胞因子表达的结果表明：断奶应激会产生短暂的炎症反应，仔猪断奶后3～7天TNF-α、IFN-γ等促炎细胞因子表达显著升高。同时，研究发现氧化锌和丁酸能改善肠黏膜形态，降低肠黏膜通透性，降低炎症细胞因子水平，增加仔猪紧密连接蛋白Occludin 和ZO-1 表达，从而保护肠黏膜屏障，降低腹泻率。研究结果为在分子水平开展肠黏膜屏障