热纤梭菌中膜上Ech氢酶复合体的功能与性质研究

Genetic modification of Clostridium thermocellum to improve its hydrogen production is a focus of study in the investigation of biohydrogen production from lignocellulose. The key to genetic modification is understanding the molecular mechanism of hydrogen production. In this proposal, the investigation of the biochemical properties and physiological function of the membrane-bound Ech hydrogenase from C. thermocellum is planned，aiming at improving the understanding of this important part of hydrogen production in C. thermocellum. Firstly, it is planned to purify Ech hydrogenase and study its biochemical and enzymatic properties to understand its subunit composition,stoichiometry and physiological electron donor. Secondly, we will express the three key subunits of Ech hydrogenase in Escherichia coli and purify them, followed by the investigation of their chemical properties, enzymatic properties and metallocenters to understand the structure and physiological substrate of each subunit. Thirdly, we will reconstruct the electron transport chain in Ech hydrogenase using its key subunits, to improve the understanding of the intramolecular electron transport mechanism of Ech hydrogenase. Finally, we will knockout the ech operon from C. thermocellum, and compare the hydrogen production and the capability of membrane-bound proton translocation to understand the proton tunnel activity of Ech and its role in hydrogen production. These investigations will improve our understanding of the physiolocal function of Ech hydrogenase from C. thermocellum and its role in hydrogen production.

对热纤梭菌进行遗传改造以提高其产氢性能是目前降解木质纤维素进行生物产氢研究的热点之一。理解热纤梭菌产氢的分子机制是对其进行遗传改造的关键。本课题拟研究热纤梭菌中膜上Ech氢酶复合体的生化性质与生理功能，以促进对热纤梭菌中Ech氢酶这一产氢机制重要环节的理解。首先，我们将纯化Ech氢酶并研究其生化性质和酶学性质，以确定其亚基构成、比例和生理电子供体。其次，我们将在大肠杆菌中表达纯化Ech氢酶的三个关键亚基，并对他们的生化性质、酶学性质和金属核心进行研究以了解各亚基结构和生理底物。然后，我们将利用Ech氢酶关键亚基来重构Ech氢酶内电子传递链，以理解Ech氢酶内的电子传递机制。最后，我们将敲除热纤梭菌中的ech操纵子，并通过比较敲除株和出发株的产氢能力和膜上氢离子转运能力来研究Ech氢酶在产氢中的作用与氢离子通道活性。通过以上研究，我们将理解热纤梭菌中Ech氢酶的生理功能和其对生物产氢的影响。

热纤梭菌是一种可以利用纤维素，将其降解并生成氢气的厌氧细菌。利用热纤梭菌降解木质纤维素生成的氢气可以被人们利用作为一种重要的可再生能源。在热纤梭菌中有多种镍铁氢酶和铁铁氢酶存在，其中六亚基的Ech型镍铁氢酶是一种重要的可以利用铁硫氧还蛋白的氢酶，其生理功能未知。在本课题研究中，我们对热纤梭菌的产氢过程和氢酶基因、蛋白、调控、功能等方面进行了详细研究。..通过我们的研究，我们发现了热纤梭菌中葡萄糖是一种重要的纤维素酶抑制剂，其可以高强度的抑制几乎所有纤维素酶的合成，在此基础上，我们发现热纤梭菌和热解糖热厌氧杆菌可以高效利用纤维素产生氢气，其效率高于仅仅利用热纤梭菌。对这两种细菌之间的相互关系的研究表明热解糖热厌氧杆菌可以解除热纤梭菌的碳阻遏效应并促进纤维素酶合成，但是同时由于热解糖热厌氧杆菌消耗了热纤梭菌的营养物质使得后者生物量严重受损，因此，两者之间的关系是一种新型的寄生而非共生关系。我们进一步对热纤梭菌及热解糖热厌氧杆菌的氢酶转录结构进行了研究，发现两个细菌中的氢酶分别由5和3个操纵子所编码，其中Ech氢酶的编码基因分别和一个Ras蛋白编码基因和镍铁氢酶的成熟蛋白编码基因共转录。通过氢酶表达水平对碳源响应的研究，我们发现，热纤梭菌中的Ech氢酶被葡萄糖显著抑制，而热解糖热厌氧杆菌的氢酶编码基因基本不受碳源调控。在单独培养和共同培养状态下的氢酶转录水平对比中，我们发现，热解糖热厌氧杆菌的氢酶编码基因在共培养状态下上调，而热纤梭菌的氢酶编码基因转录水平不变。进一步对热纤梭菌和热解糖热厌氧杆菌的产氢动力学研究表明，混合菌群中产氢能力的提高是由于热解糖热厌氧杆菌的加入提高了产氢的效率，并且提高了氢酶的转录水平。我们并对热纤梭菌中Ech氢酶的三个亚基EchC、EchE和EchF进行了异源表达、纯化和性质研究。..上述研究工作阐述了热纤梭菌中氢酶的调控机制以及共培养状态下产氢能力提高的原因，并对Ech氢酶的基因结构、转录结构、基因表达调控和功能进行了研究。该研究对进一步提高利用木质纤维素产氢能力提供了理论基础。