基于Notch信号通路MicroRNA调控探讨电针对MCAO大鼠内源性NSCs增殖分化的研究

We reported that electroacupuncture at Quchi (LI11) and Zusanli (ST36) acupoints alleviate neurological deficits probably through promoting the proliferation and differentiation of nerve stem cells (NSCs) and have strong relationship with Notch signaling transduction pathway.Recent research has demonstrated that the cross talk between MicroRNA,such as miR-124、miR-9、miR-34 and the Notch pathway plays a key role in neuronal progenitor cell differentiation and proliferation in cerebral ischemia. Using a middle cerebral artery occlusion model,we are going to explore the mechanism of electroacupuncture on regulating the proliferation and differentiation of endogenous NSCs, and the related modulation of microRNA on Notch. To investigate the underlying epigenetics mechanisms. The study will provide a theoretical and experimental basic for the clinical application of electroacupuncture.

课题组前期研究发现电针"曲池"、"足三里"有促进脑缺血后内源性神经干细胞（NSCs）增殖分化的作用，其机制与调控Notch信号通路密切相关。近来研究表明表观遗传学指标MicroRNAs如miR-124、miR-9、miR-34a通过"对话"方式作用于Notch信号分子，控制并调节NSCs增殖分化，在脑缺血功能恢复过程中扮演重要角色。本研究通过电针干预MCAO大鼠"曲池"、"足三里"穴，采用免疫荧光法观察电针干预MCAO大鼠内源性NSCs增殖分化为各类型神经细胞的数量和比例，采用stem-loop real-timePCR检测与NSCs密切相关的MircoRNAs动态表达过程，从基因和蛋白层面检测Notch信号通路中关键分子表达。探索电针对MicroRNAs与Notch信号分子相互作用的影响，以期在表观遗传学方面阐明电针对内源性NSCs增殖分化的影响，为电针的临床应用提供理论依据和实验基础。

基于“治痿病独取阳明”中医理论证实电针“曲池”、“足三里”穴不同时期促进局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖分化的变化规律：在脑缺血急性期或亚急性期至恢复期，处于静息状态的内源性神经干细胞被激活并表现在干细胞巢SVZ区大量增殖；而恢复期后内源性干细胞逐渐被分化为星型胶质细胞和神经元，其星型胶质细胞的分化早于神经元，且分化为神经元的区域局限于SVZ区及周边区域。明确了Notch1信号通路相关蛋白对电针“曲池”、“足三里”穴促进局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖分化的作用：Notch1信号通路相关因子Hes1、Hes5在电针促进神经干细胞的增殖中发挥重要作用；而Mash1、NeuroD1在电针促进神经干细胞的分化中发挥重要作用。筛选了27个差异表达miRNAs参与电针“曲池”、“足三里”穴促进局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖分化：其中miR-9a、miR-34a和miR-146b与神经干细胞的增殖分化紧密相关。明确了miR-9a在电针“曲池”、“足三里”穴促进局灶性脑缺血损伤大鼠SVZ区神经干细胞增殖的作用：miR-9a在急性期或亚急性期激活静息态内源性神经干细胞，通过上调Hes1和Hes5的表达促进内源性神经干细胞增殖，但远隔区一些神经细胞表现出干性，Nestin高表达现象有待阐释。揭示了电针“曲池”、“足三里”穴可能通过调控miR-34a促进局灶性脑缺血损伤大鼠缺血侧SVZ区及周边区Nestin+/GFAP+表达，促进其分化为星形胶质细胞。阐明了电针“曲池”、“足三里”穴通过激活miR-146b抑制Notch1下游分化关键调控蛋白MASH1、NeuroD1的表达，促进缺血侧SVZ区及周边区域内源性神经干细胞分化为新神经元，并体外实验证实miR-146b调控神经干细胞分化为神经元的作用。