鞭毛基因lafV编码蛋白在嗜水气单胞菌游动及集群运动中的调控作用及机制研究

Bacterial flagella is a delicate nano machine that drives bacterial movement through its rotation. Bacterial motility is not only related to bacterial survival, but also closely related to bacterial pathogenicity. Aeromonas species are able to cause disease both in humans and animals. During the study of the swimming and swarming motilities of Aeromonas, our team found a new putative flagella gene of unknown function. Furthermore, our team confirmed that this gene was indeed a new flagella gene by cotranscriptional analysis and the construction of the necessary knockout strains. In addition, bioinformatics analysis revealed that the homologous genes of this putative flagella gene are widely distributed in the bacteria of the genus γ-Proteobacteria. Our group name this gene lafV. The role of LafV in the regulation of bacterial movement and its mechanism is unclear. In This project, we plan to investigate the regulatory role and how LafV regulate the swimming and swarming motilities of Aeromonas hydrophila through the gene knockout, protein interaction, protein function mutant construction and other technical means. The project will clarify the regulatory role of LafV and elucidate the regulatory mechanism of LafV, including the possible mechanisms by which LafV regulates the synthesis of flagella at the transcriptional level and the possible mechanism by which LafV regulates flagellar function at the protein level. Hopefully, These results will enrich the basic theory of bacterial flagellum synthesis and function regulation, and establish a target for the further screening of new antimicrobial agents.

细菌鞭毛可通过其转动驱动细菌运动，而细菌运动不但关乎细菌生存，还与细菌致病性密切相关。气单胞菌是人兽共患病病原菌，我们在研究气单胞菌游动和集群运动时，发现了一个未知功能基因疑似新的侧生鞭毛基因。通过共转录实验及构建必要的敲除株等手段，本研究组证实该基因确为新侧生鞭毛基因，且生物信息学分析表明该基因广泛分布于γ变形菌纲细菌中，我们将其命名为lafV。为进一步研究lafV所编码蛋白在细菌运动中的调控作用及机制，本项目将运用基因敲除、蛋白相互作用、蛋白功能突变体的构建等技术手段，在嗜水气单胞菌中开展LafV调控细菌游动及集群运动的作用及机制研究。项目将明确LafV的调控作用，并阐明LafV可能的调控机制，包括LafV在转录水平调控鞭毛合成的可能机制及LafV在蛋白水平调控鞭毛功能的可能机制。研究结果将丰富细菌鞭毛合成和功能调控基础理论，为筛选新型抗菌药物确立靶标。

鞭毛作为细菌最重要的运动器官，为细菌的游动和集群运动提供动力。本项目围绕一个新发现的气单胞菌侧生鞭毛合成基因簇中的功能未知基因（lafV）开展研究，主要研究内容包括如下三个方面：（1）探究lafV是否属于气单胞菌侧生鞭毛合成基因簇。（2）探究lafV在气单胞菌游动和集群运动中发挥的调控作用。（3）探究lafV调控气单胞菌运动性的机制。我们取得了如下成果：（1）研究发现lafV广泛分布在在气单胞菌属和γ-变形菌纲内其他属细菌的侧生鞭毛基因簇中，逆转录PCR实验结果显示lafV在转录时与侧生鞭毛合成基因簇内的lafFSTU基因一起形成了一个多顺反子mRNA，lafV基因的转录受到气单胞菌侧生鞭毛合成基因簇中专属调控因子的调控，证实lafV是一个新的侧生鞭毛基因。（2）研究发现lafV基因缺失之后气单胞菌菌株AH-3的集群运动能力增强，将lafV基因回补到缺失突变株后集群运动菌落回复为与野生型类似，lafV基因缺失之后菌株AH-3的游动运动能力无显著差异，表明lafV编码蛋白很可能在气单胞菌集群运动中发挥着负向的调控作用。（3）研究发现lafV基因编码蛋白（LafV）仅含有一个PilZ结构域；提纯的复性后的重组LafV在胞外溶液中呈单体形式，每个复性后的重组LafV分子可以结合两分子的c-di-GMP，并通过保守位点分析和蛋白质点突变确认了LafV与c-di-GMP结合的10个关键氨基酸位点；圆二色谱检测结果显示LafV与c-di-GMP结合后会出现较明显的构象变化，而这种构象变化很可能参与了LafV与下游靶标分子的相互作用；实时荧光定量PCR结果显示野生株和lafV基因缺失突变株鞭毛系统基因表达水平并无明显差异，说明lafV不是通过在转录水平调控鞭毛的表达和组装来调控菌株AH-3的集群运动；通过构建LafV-GFP融合蛋白技术和基因敲除技术表明LafV定位在细胞膜上，与LafT蛋白直接相互作用，起到抑制鞭毛转动的作用，从而实现对菌株AH-3集群运动的调控作用。我们的研究结果阐明了气单胞菌AH-3菌株内一个新的侧生鞭毛基因lafV对气单胞菌集群运动的调控作用及机制，丰富了细菌鞭毛合成和功能调控基础理论，为筛选新型抗菌药物确立靶标。